利用Ambion的MicroPoly(A)Pure試劑盒分離mRNA實驗

原始細胞

乙醇

組織均化器MicroPoly(A)Pure 試劑盒

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

乙醇,100%

2. 特殊設備

組織均化器（可選），見二、方法步驟 4

水浴，預設到 70°C

3. 其他

MicroPoly(A)Pure 試劑盒（Ambion)

4. 細胞和組織

原始細胞

二、方法

1. 將洗脫緩沖液預熱到 70°C。

2.250 g 離心沉降細胞后移棄上清液。

3. 在 PBS 中溫和重懸后離心，對細胞沉降物進行第一次洗滌。棄上清液。

4. 加 250ul 裂解液。用組織均化器或通過劇烈振蕩或抽吸進行均質化。估計裂解產的體積，以作為「起始體積」。

5. 加 2 倍起始體積的稀釋緩沖液。倒置或搖動 10s 進行混合。

6.4°C 下 12000 g 離心 15 min。將上清液轉至一新管中。

7. 向樣品中加一小瓶 oligo(dT) 纖維素。倒置混合。室溫下輕柔攪動溫育 30~60 min。

8. 室溫下 4000 g 離心 3 min。

9. 轉移上清液，保存上清液直到實驗證明有 mRNA 被純化出來。

10. 向寡脫氧胸苷酸纖維素沉降物中加 1 ml 結合緩沖液，倒置混合，4000 g 離心 3 min,棄結合緩沖液，重復該步騍兩次。

11. 向沉降物中加 lml 洗滌緩沖液，倒置混合，4000 g 離心 3 min 移棄洗滌緩沖液并重復該步驟兩次。

12. 將一離心柱放入洗滌管中，在 400ul 洗滌緩沖液中重懸 oligo(dT) 纖維素。將溶液轉移到離心套柱中并于 4000 g 短暫離心，棄流過物。

13. 向離心套柱加 500ul 洗滌緩沖液。用一移液管頭混合樹脂，小心避免破壞柱中的膜。室溫下短時離心，棄流過物并重復該步驟。保存最后一次洗滌的流過物。

14. 確定流過物的 A₂₆₀。如 A₂₆₀ 小于 0.05，繼續進行方案；如 A₂₆₀ 大于 0.05, 重復用500ul 洗滌緩沖液進行洗滌，直到 A₂₆₀ 小于 0.05。

15. 將離心套柱放入一新的微量離心管，向離心套柱加 100ul70°C 的洗脫緩沖液，立即于 5000 g 離心。向離心套柱另加 100ul 熱的洗脫緩沖液并于 5000 g 短暫離心。棄離心套柱。

16. 將 20ul 5mol/L 的醋酸銨、1ul 糖原和 550ul 的 100% 乙酵加到洗脫的 mRNA 中，-20°C 沉淀過夜。

17.4°C 下大于或等于 12000 g 離心 20 min 回收 mRNA。

18. 小心移棄上清液，再次短暫離心，用一尖頭移液管移棄所有殘液。

19. 將沉降物再溶解于 1~20ul 由試劑盒提供的經 DEPC 處理的 H₂O/EDTA 中劇烈振蕩徹底溶解沉降物。于-70°C 儲存 RNA。