制備DNA測序模板實驗

大腸桿菌

LB TE M13聚乙二醇容易讓 頂層瓊脂 乙酸鈉 乙醇

巴斯德吸管 試管 離心機

1.  如果起始用M13復制型DNA或M13單鏈DNA，以0.5 ng 重組M13mp復制型DNA或5~10 ng 單鏈DNA轉化40 μl  感受態大腸桿菌DH5αF'株，按熱休克方案進行轉化。

2.  轉化細胞加0.2 ml大腸桿菌DH5αF'過夜培養物后，混勻于3 ml H頂層瓊脂，傾倒于37℃平板，倒扣后置于37℃過夜。

3.  大腸桿菌DH5αF'過夜培養物以2×TY培養液稀釋100倍，分裝于18 mm×150 mm 試管，每份1.5 ml。

4.  用無菌巴斯吸管挑取M13mp 噬斑，并置于上述每份培養物中，要注意確保瓊脂塊已玻轉移。

5.  重復進行挑斑，在37℃生長細菌5~6  h。

6.  細菌培養物移至1.5 ml 微量離心管中，于4℃或室溫高速離心5 min，上清移至一個干凈的1.5 ml 微量離心管中。

7.  噬菌體上清加入200 μl M13 PEG溶液，混勻，于室溫放置15 min，高速離心5 min，棄上清。

8.  高速離心30 s，并以頭部已拉細的巴斯德吸管吸出殘余液體。

9.  以100 μl TE重懸沉淀，加入100 μl 緩沖液平衡酚，旋渦混合器輕輕振蕩15~20 s。

10.  于4℃或室溫高速離心5 min，轉移上上清水相于一個干凈的微量離心管中。

11.  加入11 μl 3 mol/l pH5.2的乙酸鈉和250 μl 100%乙醇，于-70℃冷凍20 min。

12.  4℃高速離心10 min，棄上清。

13.  加入100 μl 冰冷70%乙醇，微量離心，棄上清，重復此70%乙醇冼滌1次。

14.  在Speedvac真空旋轉蒸犮器中干燥沉淀。

15.  沉淀重溶于20 μl 緩沖液，取0.5 μl 在小型凝膠中電泳，以確證DNA的濃度。

16.  剩余貯于-20℃直到用作模板進行測序反應。