包涵體的純化和復性總結

關于包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的復性已經成為生物制藥的瓶頸，關于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復性以及純化，內容比較龐雜

一、菌體的裂解
1、怎樣裂解細菌  ？
細胞的破碎方法
1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內臟組織、植物  肉質種子等。
2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。
3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物  材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應采取相應降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調整，超聲完全了菌液應該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應慎用。
4.反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5.化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。
無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質的提取。
這是標準配方:
裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個pH范圍內比較好發揮作用)
但我個人的經驗是:如果你裂解細菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小于20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,會引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點就夠.判斷裂解好壞的標準是,溶液很粘.
protocol是10ml-50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體.
如果只做一個鑒定,我覺得100-200ml菌就夠了.
但凡超聲,我都用60ml裂解液,因為我們的超聲儀(現代分子生物學實驗技術錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會冒泡泡,也不會灑出來.菌多我就延長超聲時間.
沉淀,也就是包涵體沉淀了,如果要上柱純化,一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以后,離心取上清,加入適量體積的loading buffer.loading buffer對于包涵體的溶解能力是較弱的.

"取200微升菌液，離心后直接加上樣buffer，100度3分鐘后上樣，然后SDSPAGE. 這個方法到底能不能溶解細菌中的包涵體? "
而樓主的問題,雖然loading buffer對于包涵體的溶解能力是較弱的,但是我覺得你的做法只是在鑒定有無表達,用loading buffer是沒有問題的.

2、表達重組蛋白時，細菌裂解方法都有哪些？
在表達重組蛋白時，誘導以后跑SDS-PAGE發現表達都很好，但是在裂解細胞時遇到問題。總是不能徹底裂解細胞。
首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細菌沒有裂解。
我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復99次。然后顯微鏡觀察，不徹底時再重復99次。菌體來自200 ml培養液，用20 ml PBS重懸。
然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100 ug/ml，4C半小時菌液不變粘，加大濃度至1 mg/ml，半小時后仍無明顯變化。因為我用的PBS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小時仍無明顯變粘。因為這次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒有明顯變化。
真是郁悶。到底出了什么事？請高手解答，并介紹優化的方案。
同時希望能介紹一下如何選擇細胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。
溶菌酶在pH7.4時是否沒有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應如何保存？
加入溶菌酶以后，如果細胞壁已破壞，菌液應該變粘吧，因為核酸被釋放出來。
而超聲破碎細胞，我覺得菌液是不會變粘的，因為超聲可以把大分子核酸打碎成小片段。
我判斷細胞破碎不完全是因為，在將破碎后樣品離心分離上清和沉淀跑SDS-PAGE觀察，發現在細胞碎片組分中除了經常出現的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現。據此可以判斷細胞只是部分破碎。
不知我的分析是否正確，請版主和各位高手指教。
如果溶菌酶效果還可以，我覺得先用溶菌酶初步裂解細胞，然后再用超聲進一步破碎并斷裂大分子核酸以降低粘度的細胞破碎策略可能比較好。因為超聲有可能使蛋白變性，但單用溶菌酶不能確定是否完全破碎，還要再加核酸酶降低粘度。這種兩步法策略應該還可以減少破碎條件優化的時間。
我用的溶菌酶放置時間比較長了，有可能失活了。我剛從生工又定了一支，不過得后天到貨，但愿它有用。
如何觀察溶菌酶是否已裂解細胞，通過觀察粘度變化是否可以？
只反復凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細胞？
溶菌酶只有在pH值大于8.0的條件下才能發揮溶菌作用，請務必保持PBS的pH＞8.0，同時溶菌酶的量一定要足！