單分子測序在腫瘤基因檢測中的6大應用

　　腫瘤是當今導致人類主要死亡的主要疾病之。由于其發病隱匿、治療方法局限、多數預后不良,且分子生物學特征復雜多變,因而腫瘤的預防、早期篩查與診斷、臨床治療、預后評估一直是臨床醫生致力于解決的關鍵問題。隨著現代醫學技術的發展,腫瘤已經進人了個體化治療階段。腫瘤的基因組轉錄組和表觀遺傳特征在探究腫瘤的發生、轉歸和個體化治療中起到了重要作用。

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　　在前文中，小編匯總了當前發展的4代基因測序技術并總結了每代技術的優勢。在本文中，小編將帶您了解第三代測序技術在腫瘤研究中的應用情況。

單分子測序技術種類

　　目前，單分子測序技術主要包括單分子基因組測序、單分子轉錄組測序和單分子表觀遺傳測序,以便從不同角度揭示腫瘤微環境中不同細胞的特性

　　單分子基因組測序

　　單分子基因組測序主要包括單分子全基因組測序和單分子全部外顯子測序。主要用于鑒定單核苷酸變異、拷貝數變異（copy number variations, CNV）和染色體結構變異。

　　單分子轉錄組測序

　　最常用的方法為單分子全轉錄組測序,對單分子中mRNA進行基因表達定量、功能富集、代謝通路分析。

　　單分子表觀遺傳測序

　　單分子表觀遺傳測序主要是研究DNA的表觀遺傳修飾,如甲基化、羥基化以及組蛋白修飾等。目前最為常用的是單分子甲基化測序（ single cell methylation sequencing,scMseq）。scm-seq主要有3種方法:

　　（1）單分子限制性代表區域甲基化測序（ methylation sequencing of single cell restricted representation regions, SCRRBS-seqg）；

　　（2）單分子亞硫酸氫鹽測序（ single --cell bisulfite sequencing, scBSseq）；

　　（3）單分子全基因組甲基化測序技術（ single-cell whole genome bisulfite sequencing, SCWGBS-SEQ）。

　　其中scBS-seq覆蓋的GpG位點最多,約370萬個。

　　多組學測序

　　同時進行單分子基因組和轉錄組測序的方法主要有3種:

　　（1）scGT-seq（ single-cell genome and transcriptome codetection and sequencing）采用微流體的方式將兩者分離進行測序；

　　（2）G&T-seqg（ genome and transcriptome sequencing）:采用物理方法將兩者分離測序；

　　（3）DR-seq（gDNA -MRNA seque）。

單分子測序技術在腫瘤研究中的應用

　　揭示腫瘤發展過程中單分子基因變異

　　Kim等從2個肺腺癌患者來源的腫瘤細胞異種植入的小鼠(PDX)中提取了83個細胞進行單分子轉錄組測序,對其中43個小鼠的重復樣本進行全外顯子測序,觀察到包括 KRASG12D在內的50種腫瘤特異性單核苷酸變異,發現了所有的PDX細胞之間均具有異質性。

　　Ni等通過對一種肺瘤亞型(不包括其它亞型)的循環腫瘤細胞進行單分子外顯子測序,發現個體(甚至不同)患者的CTC中一些高度重現的CNV與耐藥相關,一些基因位點(如c-Myc,TERT,HLA)的特定組合的CNV與轉移相關,可能的機制是:原發性腫瘤中的癌細胞與某些CNV可以侵入周圍組織并有效浸潤,這也可能使CTC發生免疫逃逸。

　　發現腫瘤的異質性

　　腫瘤的異質性是腫瘤細胞増殖過程中細胞遺傳物質在復制、轉錄和翻譯的不同層面發生變化,導致子代細胞在基因型和表型中均存在差異。腫瘤的異質性主要體現在4個層面:不同腫瘤之間、同一腫瘤的不同病灶之間、同一個腫瘤的同一個病灶的不同區域、同一腫瘤的同一病灶的同一區域的不同細胞之間。Kim等用腎切除術后1年內出現獨立肺轉移灶的透明細胞性腎細胞癌患者的肺轉移的腫瘤組織,以及原發的及肺轉移的腫瘤細胞異種植入的小鼠的116個細胞進行單分子RNA測序,在單分子水平上發現了腫瘤內部的異質性,發現頑固性患者體內有不同的靶向藥物通路活化,制定了靶向轉移的癌細胞中的兩個相互獨立的通路的治療戰略。

　　Hou等從1例患者的骨髓樣本中隨機選取了82個骨髓細胞以及8個正常口腔黏膜上皮細胞,進行了單分子全部外顯子測序,發現骨髓增殖性腫瘤患者的腫瘤細胞與正常細胞的基因表達譜完全不同腫瘤細胞之間的基因表達也存在差異,呈現遺傳多樣性。發現不同的細胞同時存在多種基因突變的短暫時期,其中有明顯的生長優勢的細胞群發展成為腫瘤。

　　探究腫瘤各亞型之間的基因序列差異

　　Venteicher等對10例IDH-A腫瘤患者的9879個単細胞和6個IDH-O腫瘤的4347個單分子進行了單分子轉錄組測序,并將測序結果與165個TCGA的數據對比,發現在IDH-A和IDH-O中觀察到有相同的膠質譜系和發育層次結構,表明所有IDH突變膠質瘤起源于同一個祖細胞。與神經膠質譜系的相似性相反,IDH-A和IDH-O在其腫瘤微環境中差異顯著,特別是小膠質細胞/巨噬細胞的富集程度。小膠質細胞和巨噬細胞在不同臨床分期的IDH-A腫瘤之間也不同。這一研究成果對于此類疾病的管理和治療具有重要意義。

　　Casasent等到從10例乳腺導管原位癌和浸潤性導管癌患者的腫瘤組織中分離了1293個細胞,并對這些細胞進行了外顯子測序,發現了浸潤性導管癌與導管原位寤原位癌之間有直接的基因相關性(有相同的突變和CNAs),來自同一個譜系,在發生浸潤性改變之前就已經發生浸潤性導管癌中的基因突變和復制子變化,一個或多個克隆遷移到周圍組織形成了浸潤性腫瘤。

　　區分腫瘤中免疫細胞亞群

　　heng等從6例肝細胞癌患者的外周血、腫瘤組織、腫瘤鄰近部位正常組織中分離了5063個T細胞,進行了單分子轉錄組測序,對T細胞進行了細胞亞群分類、發展軌跡分析,比較了不同亞群中T細胞克隆的分布,探討了不同亞群之間的關系,發現了每個亞群的特異性基因表達,發現相較于外周血和癌旁組織的T細胞,腫瘤組織中大量存在CD8T細胞的功能紊亂及抑制性T細胞。并證明 Layili基因對于CD8'T細胞的系傷功能有抑制作用,可能會成為免疫療法的新靶點。同時,基于TCR數據分析發現,肝瘤內存在大量處于耗竭狀態的T細胞,揭示了腫瘤細胞免疫逃逸的原因。此外,該研究還描繪了初始T細胞向耗竭狀態的發展軌跡,并在耗竭性CD8T細胞亞群中發現了一類FOXP3抑制性T細胞的存在,提出了耗竭的CD8*T細胞可能會進步發展成抑制性T細胞。

　　探索腫瘤的發生過程

　　Tanga等運用最新的 serio-seq技術對1例肝癌患者癌組織中的25個癌細胞同時進行了3種組學的分析。發現這25個肝癌細胞來自2個不同的細胞亞群。在基因組水平上,亞群1中的細胞含有較多拷貝數增加的染色體及染色體片段,而亞群I中含有較多拷貝數減少的染色體和染色體片段；在DNA甲基化水平上,亞群1比亞群1有更高的DNA甲基化水平,且產生的差異大多發生在CpG島(CGID)區域；在轉錄組水平上,多個與炎癥免疫應答相關的基因,以及與補體激活相關的基因表達在亞群1中都明顯降低,而與癌癥發生和轉移相關的重要基因ANO1和S100A11等的表達在2個亞群中也有明顯差別。對于多種組學數據的分析顯示,在被檢測肝癌細胞中,數量上占比較小的亞群I的細胞的DNA拷貝數變異更多,且DNA甲基化水平更高,可能更易逃脫患者免疫系統的識別,更易出現腫瘤轉移。

　　闡釋腫瘤的耐藥機制

　　Miyamoto等從13例雄激素抵抗(AR)的者體內收集77份CTC進行單分子轉錄組測序。通過將AR患者CTC與未進行治療患者的CTC進行對比,發現AR組Wnt信號通路激活。從而闡釋前列腺癌細胞對雄激素剝奪療法抵抗的原因。Kim等從2例肺腺癌患者來源的腫瘤細胞異種植入的小鼠(PDX)中提取了83個細胞進行單分子轉錄組測序,對其中43個小鼠的重復樣本進行全外顯測序,觀察到包括KRASG12D在內的50種腫瘤特異性單核苷酸變異,發現了所有的PDX細胞之間均具有異質性。作者根據KRAS突變和69個肺腺癌預后基因表達的風險評分將PDX細胞分為4組,發現表達 KRASG12D和低風險評分的組的PDX細胞在體外抗癌藥物治療后依舊存活,說明表達KRASG12D和高RS的PDX細胞可能與耐藥相關。此外,高表達KRASG12D和高RS的PDX細胞會掩蓋無KRASG12D ( KRASWT)和/或低RS細胞類型。具有不同作用機制(細胞毒性和靶向特異性信號轉導途徑)的殺腫瘤抗癌藥物能將高表達 KRASG12D和高RS的細胞轉變為低表達KRASG12D和低RS的PDX。從而說明（1）具有激活的KRAS標簽的腫瘤細胞是藥物靶標,但KRAS突變本身不是靶標；（2）與耐藥性相關的腫瘤群體可能被群體內的顯性基因組特征的群體掩蓋；（3）參與離子通道轉運的基因和P型ATP酶的上調可能在耐藥性中起關鍵。

展望

　　基因突變的積累是導致腫瘤發生發晨的根源,而目前導找癌癥突變基因最有效的方式就是基因測序。隨著分子生物學的飛速發展，單分子測序技術將逐漸代替NGS技術成為腫瘤基因檢測的主流手段。雖然單分子測序技術尚存在一些局限性,但它為研究腫瘤發生發展和轉移的分子機制提供了新技術,有望在腫瘤的早期診斷、病程進展和治療的方面提供新的預防和治療手段。