單細胞mRNA差異顯示實驗

溶液和緩沖液

水浴槽 PCR熱循環儀 微量離心機 塑料制品和濾器

一、RNA 的分離

1. 收集對照組和實驗組細胞，放入含 45ul2 mmol/L DTT 的 1.5 ml 微量離心管中。

2. 95℃ 水浴熱解 2 min。

3. 每管加入以下物質：
   

4. 37℃ 溫育 30 min。

5. 加以下物質：
   

6. 溫育 37℃15 min。

7. 加 DEPC 處理過的 H2O 至終體積 200ul。

8. 加 200ul 酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)。

9. 振蕩 30s。

10. 微量離心機 14OOOg 離心 5 min。

11. 將上清轉移到干凈的 1.5 ml 管中，加 200ul 氯仿/異戊醇（24:1)。

12. 振蕩 30s。

13. 微量離心機 14000 裒離心 2 min。

14. 加入 1ul(10ug）糖原，20ul3mol/L 乙酸鈉（pH5.2) 和 600ul 100% 乙醇,-20℃ 過夜沉淀 RNA。

    注意：在以下所沉淀步驟中不需要加糖原和過夜。

15. 在 4℃ 微量離心機中離心 14000 gX30 min。

16. 小心除去上清，加入 200ul 70% 乙醇。

17. 微量離心機短暫離心。

18. 小心除去上清液，室溫下干燥沉淀物 5 min。

19. 按下一步驟的要求重溶解沉淀物。

    二、cDNA 的合成

    1.加入 10ul 經 DEPC 處理水重溶 RNA 沉淀物，加入 1ul（10ug）T7digo（dT)18。

    2.95℃ 水浴 2 min 使 RNA 變性，在冰上快速冷卻。

    3.加以下物質：
    

    4.37℃ 溫育 lh。

    5.加以下物質：
    

    6.16℃ 水浴溫育 2 h。

    7.按上述 RNA 的分離第 7~19 步進行酚/氯仿/異戊醇抽提、氯仿/異戊醇抽提以及乙醇沉淀。

    8.加入 10ul 水重溶雙鏈 cDNA 沉淀物，用 50 ml TE 液（無 RNA 酶）透析 4 h(溫和地將 cDNA 轉移到 0.025um 微孔濾器上，濾器浮于含 50 ml 無 RNA 酶 TE 液的錐形管中。4 h 后將樣本轉移到 1.5 ml 的反應管中，用 5 經 DEPC 處理過水漂洗濾器，并將洗液加入同一管中)。

    三、aRNA 的合成

    1.每 15.2ul 上述步驟所得雙鏈 cDNA 溶液中加入以下物質：
    

    2.37℃ 溫育 4 h。

    3.加入以下物質：
    

    4.37°C 溫育 30 min。

    5.按上述 RNA 的分離第 7~19 步進行酚/氯仿/異戊醇抽提、氯仿/異戊醇抽提以及乙醇沉淀。

    四、從 aRNA 合成 cDNA

    1.加入 10ul 經 DEPC 處理水重溶 aRNA 沉淀物, 然后加入 1ul(10ng) 六核酸引物。

    2.95°C 水浴 2 min 使 aRNA 變性，在冰上決速冷卻。

    3.加以下物質：
    

    4.37℃ 溫育 lh。

    5.按上述 RNA 的分離的第 7~19 步進行酚/氯仿/異戊醇抽提、氯仿/異戊醇抽提以及乙醇沉淀。

    6.按上述 cDNA 的合成的第 8 步進行透析。

    7.把 cDNA 轉移到干凈的反應管后，加入經 DEPC 處理水至終體積 50ul。

    五、DD-PCR

    1.在 0.5 ml 反應管中加入以下物質：
    
    

    2.當所用的熱循環儀沒有預熱頂蓋時，可以在反應管中加一滴植物油，以防止水分蒸發。

    3.將反應管放入預先加熱到 94℃ 的熱循環儀，進行 PCR 前先溫育 3 min。

    4.循環 40 次。
    

    5.加 8pd 甲酰胺加樣緩沖液，94°C,5 min 使 DNA 變性。

    6.5% 變性聚丙烯酰胺測序凝膠電泳，每孔加樣 6ul 走膠，直至二甲苯青 FF 達凝膠全長的 3/4 處。

    7.用塑料薄片覆蓋濕凝膠，無須固定，放射自顯影過夜，用熒光墨水標記凝膠四角。

    8.利用突光點作為標志物準確排列經曝光膠片和凝膠，切下目的膠條，放入干凈的 1.5 ml 反應管中。

    9.每個膠條中加 500 凝膠洗脫緩沖液，95℃ 水浴 10 min, 室溫放置 16 h。

    10.取 200ul 含目的 PCR 產物的凝膠洗脫緩沖液，加入干凈的 1.5 ml 反應管中，加 1ul(10ul）的糖原，按上述 RNA 的分離第 7~19 步沉淀 DNA。

    11.用 10ul 經 DEPC 處理水重溶 DNA 沉淀物。PCR 產物此時可在-20°C 儲存，小部分樣品（如 1~3ul) 可用于重新擴增（引物同 DD-PCR 反應）以及隨后克隆或測序。重新擴增時 PCR 循環的次數嚴格根據初始 PCR 產物從聚丙烯酰凝膠中的回收率而定。一般來說，20~40 個循環可以獲得足夠的產物用于后續的克隆。我們推薦使用市售試劑盒來直接克隆經重新擴增的 PCR 產物，如 Invitrogen 公司的 TOPOTA 克隆試劑盒。

六、結果

我們已經用單細胞 mRNA 差異顯示技術來鑒定參與軟體動物兩個已知神經元之間突觸形成過程的基因（VanKesterenetaL1996)。靶細胞選定之后，發現神經元之間突觸 聯系的形成同時依賴于突觸前以及突觸后神經元的基因表達改變。知道這些變化的本質，對我們了解神經發育、神經元的可塑性以及神經系統的再生 IP 非常重要。因上述方法中包含 aRNA 擴增，這大大增加差異顯示形式的可重復性。我們已經發現了 30 多個上調基因和下調基因（圖 3-5)。目前正在對這些基因進行鑒定。

試劑清單