單鏈抗體的噬菌體展示技術

基 本 方 案 1 全套單鏈抗體噬菌體載體的構建

材 料

新鮮分離的小鼠脾臟或者 IO7 雜 交 瘤 細 胞（單 元 1*3)

R N A 提取試劑

R T -P C R 試劑

D E P C 水

寡 核 苷 酸 引 物（表 14. 3.1)

DNA marker

瓊脂糖膠回收試劑盒（Qiaquick Gel Extraction kit， Qiagen)

10m m o l / L Tris ? C U p H 8. 5

Vent D N A 聚合酶

d N T P (由 R T -P C R 試劑盒提供）

P C R 緩 沖 液（由 R T -P C R 試劑盒提供）

噬 菌 粒 載 體（如 P C A N T A B 5E )
限制酶 S / il、 及相應緩沖液

B S A

T 4 D N A 連接酶和 10X 連接緩沖液

電轉感受態菌￡：coli T G - I
S O C 培養基

Y T A G 瓊脂平板： Y T 培養基， 2 X (附 錄 1 ) 含 0 . 4 % 葡萄糖， 100/xg/m l 氨芐青霉素

Y T A G 培養基： Y T 培養基， 2 X ，含 和 不 含 15% (V A O 甘 油 ， 100/xg/m l 氨芐青霉素

P C R 儀

I.5m l 微量離心管

電穿孔儀器

0.2c m 容器

13c m 無菌離心管

接種環

1 . 用 R N A 提取試劑盒提取脾臟或者細胞的總 R N A 。溶 解 在 0.5 ml D E P C 水中 ，作為R T -P C R 模 板 。剩 佘 的 R N A 分 裝 成 50M 1/管 ，一 70℃ 保存。

2 . 根 據 R T - P C R 試 劑 盒 說 明 配 制 4 管 48/xl 反 轉 錄 反 應 體 系 ，每 管 包 含 20/xg 的總R N A ， 0. 5 ug oligo d T 。 95°C 孵 育 I O m i n 后放于冰上終止反應。

3 . PCR擴增：每 管 加 入 下 列 引 物 混 合 物（表 14.3.1)，引物的終濃度為 50pmol/50ul反應體系，總體積為 2m l 。

管 1 : 引物Mu-VH1-6-BACK(引物 NO.1?6，根據表 14.3.1 的比例混合）和引物M u -J H l - F O R (S ) (引物 N o .10)。