雙同源重組報告系統可同時對三種細胞群進行標記示蹤

　　2019年11月26日，國際學術期刊Journal of Biological Chemistry 在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心/生物化學與細胞生物學研究所周斌研究組的科研成果“Triple-cell lineage tracing by a dual reporter on a single allele”。該研究基于Dre-rox和Cre-loxP雙同源重組系統，構建了一種新的雙同源重組報告系統，可以達到在體內同時標記示蹤三種細胞群。這一研究為新型雙同源重組報告系統的構建提供了新的思路，進一步擴充了雙同源重組報告系統庫，并為發育、疾病和再生研究提供了新的技術選擇。

　　基于基因位點特異性重組酶系統的遺傳譜系示蹤技術被廣泛應用于器官發育、組織再生和疾病研究。目前，多種重組酶系統被普遍使用，例如Cre-loxP、Flpe-frt和Dre-rox系統。其中使用最普遍的為Cre-loxP系統。Cre重組酶受組織或細胞特異性啟動子驅動，當Cre識別兩個同向loxP位點之后，會誘導Cre-loxP重組，并將兩個loxP位點之間的轉錄終止序列切除，從而使轉錄終止序列之后的報告基因表達。由于這種切除事件發生在基因水平上，具有永久性和不可逆性，因此表達Cre的細胞群及其子代細胞（無論是否還在表達Cre）都將永久性地被報告基因蛋白所標記。

　　目前，已經有多種雙同源重組報告系統被構建，可多方式地對靶細胞進行標記，進行更精確的譜系示蹤研究。例如R26::FLAP，RC::Fela，R26NZG，RC::RLTG，IR1，NR1，R26-TLR等，可在體內同時標記更精確的兩種細胞群。在以往的雙同源重組系統中，由于兩種重組酶識別位點的排列方式是相間排列或嵌套排列，其兩種報告基因的表達會彼此影響，無法各自獨立表達。而且它們無法在體內同時標記更多的細胞群。在器官發育或組織再生中，一種細胞可能有多種發育起源，例如在心臟發育中，其成纖維細胞、脂肪細胞、周細胞、冠狀動脈內皮細胞起源于心臟心內膜細胞和心外膜細胞。同時，一種干細胞可能會分化為多種細胞類型，例如小腸隱窩Lgr5+干細胞能分化為潘氏細胞、杯狀細胞、腸內分泌細胞及腸上皮細胞等各種小腸特化細胞。因此，構建一種新的具有在體內同時對多種細胞群進行標記能力的雙同源重組系統將對發育和再生生物學研究具有重要意義。

　　為了解決這一問題，研究人員基于Dre-rox和Cre-loxP同源重組酶系統，構建了一種新的雙同源重組報告系統，稱為R26-TLR（Rosa26-traffic light reporter）。R26-TLR的具體結構為Rosa26-CAG-rox-Stop-rox-Zsgreen-insulator-CAG-loxP-Stop-loxP-tdTomato。當發生Dre-rox重組后，ZsGreen基因會表達，而發生Cre-loxP重組后tdTomato基因會表達。ZsGreen和tdTomato的表達能夠受獨立的重組事件調控而不會相互影響。當一個細胞同時表達Dre和Cre重組酶時，這個細胞會同時發生Dre-rox和Cre-loxP重組而同時表達ZsGreen和tdTomato。所以這個系統可對三種細胞群進行同時標記示蹤。研究人員進一步利用Sftpc-DreER；Scgb1a1-CreER；R26-TLR三基因型小鼠進行體內驗證。Sftpc是肺臟II型肺泡上皮細胞（AT2 cell）的分子標記，Scgb1a1是支氣管棒狀細胞（club cell）的分子標記。Sftpc+Scgb1a1+雙陽性支氣管肺泡干細胞（BASCs）位于支氣管和肺泡交界處（BADJs），是一群新發現的多潛能肺上皮干細胞。對以上三基因型小鼠進行Tamoxifen誘導后，收取肺臟組織進行免疫熒光分析，證實了R26-TLR特異性地在體內同時將Sftpc+ II型肺泡上皮細胞標記成ZsGreen+tdTomato– 綠色熒光，將Scgb1a1+ 棒狀細胞標記成tdTomato+ZsGreen–紅色熒光，將Sftpc+Scgb1a1+ BASCs標記成ZsGreen+tdTomato+黃色熒光。進一步對肺臟進行損傷，發現可同時示蹤這三種細胞群的在肺損傷修復中的不同響應情況。發現在萘（Naphthalene）誘導的支氣管上皮損傷修復過程中，tdTomato+ZsGreen– 示蹤的棒狀細胞主要負責再生遠離支氣管末端的棒狀細胞和纖毛細胞，而ZsGreen+tdTomato+示蹤的BASCs負責再生支氣管末端的棒狀細胞和纖毛細胞。在博來霉素（Bleomycin）誘導的肺泡損傷后，ZsGreen+tdTomato– 示蹤的II型肺泡上皮細胞負責修復再生遠離BADJ的肺泡上皮，而ZsGreen+tdTomato+示蹤的BASCs負責再生BADJ附近區域的肺泡上皮。總結來講，R26-TLR可在體內同時標記三種細胞群，為發育、疾病和再生研究提供了新的研究工具。

　　該研究工作在研究員周斌的指導下，由研究生劉擴等完成，并得到了研究員季紅斌的大力支持，同時得到中科院、國家基金委、國家科技部、上海市科委等的資助。

雙同源重組系統R26-TLR可同時在體內對三種細胞群進行標記示蹤