土壤微生物總DNA提取及純化

實驗概要

從土壤微生物中提取總DNA并純化，高質量的DNA可用于后續文庫構建。

主要試劑

TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)

PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂HPO₄, 2 mmol/L KH₂PO₄, pH 7.4)

DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃PO₄, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)

蛋白酶K(25 mg/mL)

溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)

20% SDS

氯仿

異戊醇

異丙醇

70%乙醇

RNAse 20 mg/mL

QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒(Qiagen)

主要設備

50mL、1.5 mL離心管

搖床

高速離心機

水浴鍋

電泳槽

電泳儀

渦旋儀

實驗材料

土壤樣品

實驗步驟

1. 總DNA提取：

    (1) 取2 g土樣，置于50mL滅菌的離心管中；

    (2) 加入10 mL TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)懸浮土樣，200轉搖床振蕩10min充分混勻；

    (3) 10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復洗滌多次至上清基本為無色；

    (4) 用5 mL PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂HPO₄, 2 mmol/L KH₂PO₄, pH 7.4)漂洗一次；

    (5) 沉淀加入13.5 mL DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃PO₄, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)，混勻后加入100 μL蛋白酶K(25 mg/mL)和200 μL溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)，37℃水浴30 min，每隔10 min顛倒混勻；

    (6) 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min顛倒混勻；

    (7) 8 000 r/min室溫離心15 min，取上清，用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次；

    (8) 水相中加入0.6倍體積的異丙醇，4℃沉淀過夜；

    (9) 11 000 r/min 4℃離心20 min收集DNA沉淀；

    (10) 70%乙醇漂洗兩次，干燥后用100 μL ddH₂O(含RNAse 20 mg/mL)溶解，轉入1.5 mL離心管。

2. 總DNA純化：

    (1) 配制0.8%瓊脂糖凝膠；

    (2) 每個上樣孔加入50 μL粗DNA，進行低電壓長時間電泳(4℃, 25 V, 8 h)；

    (3) 電泳結束后，切下主帶所在的凝膠(膠的體積盡可能小)；

QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒(Qiagen)回收：加入3倍體積的Buffer QXⅠ及適量的QIAXⅡ(Glassmilk)，55℃溫浴10 min，每隔2 min輕輕用手指彈起沉淀(回收大片段時不要渦旋)，待凝膠完全溶解，12 000 g離心1 min，棄上清；再加入500 μL Buffer QXⅠ洗滌沉淀1次以消除剩余凝膠；再用500 μL Buffer PE洗滌沉淀2次，將沉淀晾干，加入適當體積的ddH₂O，離心后收集上清，瓊脂糖凝膠電泳確定回收效率。