在基因組范圍定位DNA甲基化

　　DNA甲基化在哺乳動物基因表達中扮演了重要角色。盡管通過線粒體遺傳且隨時間穩定，但是細胞分化、疾病或環境影響都會改變DNA甲基化的模式。近年來，科學家們開發出多種新方法，試圖在基因組范圍定位DNA甲基化。

　　盡管從理論上來說，全基因組亞硫酸氫鹽測序能讓研究人員全面觀察甲基化組，但它還是面臨技術以及費用上的問題。測序覆蓋通常對GC含量非常高和非常低的區域有偏見，即使是在20-40倍覆蓋度，全基因組亞硫酸氫鹽測序仍不能檢測出低密度CpG島的某些甲基化差異。對于此，Broad研究院的 Christoph Bock認為，盡管更深度測序是解決方案，但費用是主要問題。在全基因組亞硫酸氫鹽測序變得更實惠之前，研究人員只能采取代表性較低的亞硫酸氫鹽測序，來選擇性掃描甲基化組。

　　有些研究人員采用甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)或通過親和純化的甲基化DNA捕獲(MethylCap)，再加上測序，來研究感興趣的甲基化區域。Bock及其同事去年10月在《Nature Biotechnology》上發表了一篇文章，比較了這幾種方法。

　　根據他們的分析，研究小組發現每種方法都各有優缺點。他們認為，MethylCap-seq比MeDIP-seq更好，不過差異不大，而且也可以優化MeDIP-seq，讓它表現更佳。就亞硫酸氫鹽測序和MethylCap-seq而言，Bock認為后者在基因組覆蓋度上表現更佳，但對實驗偏差也更為敏感。

　　至于選擇哪一種方法，Bock認為這在很大程度上取決于樣品和生物問題。當實驗室開展少量或中等數量樣品的DNA甲基化圖譜分析時，若DNA量充足，且樣品間質量相似，那么MethylCap可能提供最佳的基因組覆蓋度，特別是當預計的DNA甲基化差異相對大時。

　　然而，如果以上條件不滿足，那么亞硫酸氫鹽測序將是更好的選擇，它對實驗偏差沒那么敏感，比如批次影響、實驗室間的差異或DNA質量不同所引入的差異。

　　總的來說，他們檢測的這些方法都很有用，但無一是全面的，能夠鑒定出樣品中存在的所有DNA甲基化差異。它們一般能更好地鑒定出富含CpG區域的甲基化差異，而不是CpG較少區域。

　　對于有些疾病樣本，珍貴且稀有，無法用于常規的分析。于是，一些新方法也不斷涌現而出。

　　華盛頓大學的Rob Mitra著眼于復雜組織的甲基化分析。他正在開發一種名為MethylMap的方法，將多重擴增、條形碼和單分子亞硫酸氫鹽測序融合起來，對激光捕獲顯微切割(LCM)的樣品進行分析。

　　利用MethylMap，Mitra的小組計劃對多種癌癥患者的腫瘤樣本及周圍組織進行鑒定。他表示，開發這項技術主要是為了了解甲基化在腫瘤發展中的作用。他相信MethylMap有望應用于臨床，這種分析少量細胞中全基因組范圍甲基化的能力還可能鑒定出疾病的生物標志物。

　　無獨有偶，康奈爾大學的Paul Soloway也致力于小規模的表觀遺傳學變化分析。他正在開發一種基于納米流體學的技術，有望檢測出單分子水平的甲基化差異。此技術名為SCAN，意為納米規模的單染色體分析。

　　據Soloway介紹，從原理上來看，它類似于流式細胞儀。流式細胞儀是處理整個細胞，而SCAN是處理染色體片段。當然，前者是利用細胞表面標志物的抗體，而后者是利用組蛋白和組蛋白變異體的抗體以及識別甲基化DNA的蛋白。

　　利用SCAN，研究人員通過電壓梯度驅動單個標記分子在納米通道中流動，當分子穿過某一點時，利用激光誘導的熒光共聚焦顯微鏡進行成像。由于他們要觀察的是單個分子，而不是單個細胞，所以他們需要的靈敏度也要比細胞分選要高得多。

　　盡管還需要優化，但Soloway認為SCAN方法具有一些獨特的優勢。首先，你能同時詢問一個樣品中的多個表觀遺傳學標志，而不是重新開展免疫沉淀實驗，來驗證兩個或更多獨立的表觀遺傳學標志。第二個優勢是它需要的樣本量極少。

　　Soloway表示，他們正在優化SCAN平臺的通量，并不斷改造，希望最終能運行多個平行的納米流體通道。研究小組還希望在SCAN平臺上增加分選功能，像流式細胞儀一樣，具有分析和制備兩種功能。