基于EVAGREEN?方法的CRYSTAL數字PCR絕對定量檢測

基于EVAGREEN^?方法的CRYSTAL數字PCR絕對定量檢測

EvaGreen^?是一種無致突變性、無細胞毒性的DNA結合染料，Naica^TM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統可兼容EvaGreen^?染料進行的數字PCR實驗分析。

反應體系中游離的的EvaGreen^?染料不發出熒光信號，但與雙鏈DNA（dsDNA）結合后會發出很強的熒光。Naica^TM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統使用檢測參比熒光（熒光素鈉鹽）相同的濾光片可進行EvaGreen^?染料熒光信號的檢測。

使用Naica^TM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統，EvaGreen^?可以通過使用簡單的引物來實現靶標絕對定量。使用我們的Sapphire芯片、基于EvaGreen^?的方法可檢測低至0.2copies/μL。

圖1：基于EvaGreen^?染料方法的基因組DNA絕對定量

對未進行片段化的人基因組DNA進行倍比稀釋，濃度范圍從1000-0.2copies/μL，使用Naica^TM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統進行絕對定量，使用1.5XEvaGreen^?，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴增片段大小為104bp的EGFR基因片段。為了保證重復性和穩定性我們進行了三次重復（R²= 0.9977）。在NTC（無模板對照）孔中沒有觀察到陽性微滴。

EVAGREEN^?核酸絕對定量實驗的建立

當使用EvaGreen^?方法進行數字PCR實驗時，需要注意，加入PCR mix的模板dsDNA濃度過高將導致較高的背景熒光。此外，EvaGreen^?染料與dsDNA具有較高的親和力，但同時也與存在mix中的寡核苷酸有較低的親和力，導致背景熒光的增加。

根據您所需定量的DNA類型和數字PCR反應體系，需要預估實際的動態范圍。

圖2：EvaGreen^?絕對定量散點圖

對未片段化的人類的基因組DNA進行倍比稀釋后，濃度范圍1000-0.2copies/μL，使用Naica^TM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統進行絕對定量，使用1.5XEvaGreen^?，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴增片段大小為104bp的EGFR基因片段。

灰色點：陰性微滴，藍色點：陽性微滴。

RFU：相對熒光強度。