基因合成實驗

DNA

dNTP DAN聚合酶 乙醇 TE 限制性內切核酸酶緩沖液

水浴鍋 培養箱

1. 將兩種寡核苷酸各1 μg加入微量離心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×測序酶緩沖液。70℃加熱5 min，然后在合適的退火溫度下保溫5 min，取2 μl 留待以后的分析。

2. 加2μl 4種dNTP混合液和10U測序酶，30℃溫育30min。

3. 70℃ 10min 滅活DNA聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。

4. 加10×限制性內切酶反應緩沖液，加水和20——100 U 的適合于克隆的限制性內切酶至100 μl。適當的溫度下消化2 h以上。

5.  酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸銨和400 μl的無水乙醇，-70℃沉淀15 min，離心5 min，沉淀重懸于100 μl TE緩沖液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗滌沉淀，干燥，20 μl TE緩沖液溶解，取2 μl用于以后的分析。

6. 用篩分型瓊脂糖凝膠電泳分析確證原材料、延伸產物和酶切產物，估計延伸的寡核苷酸的量，再用適當的載體亞克隆。

7. 對幾個合適的亞克隆測序。

1. 反應液的配制、分裝請一定使用新的（無污染）槍頭、Microtube等，盡量避免污染。

2. 配制反應體系時，應注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻都要用振蕩器進行，避免產生氣泡。