基因檢測：NGS在病原微生物檢測中的應用

文章導讀

　　感染性疾病是當今世界嚴重威脅人類健康的重大疾病。目前，全球感染性疾病的發病率有所上升，病原體呈現多樣化和復雜化的發展趨勢。近年來快速發展的NGS技術因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設計，可直接對未知病原微生物進行檢測，打破了傳統微生物檢驗的局限性，在臨床微生物領域展現了廣闊的前景。

感染性疾病簡介

　　感染性疾病多為細菌、病毒和真菌等病原體及其產物所引起的局部或全身性炎癥或器官功能障礙，具有較大的危害性和較高的病死率。目前，全球感染性疾病的發病率有所上升，病原體呈現多樣化和復雜化的發展趨勢。

　　重癥急性呼吸綜合征、新型冠狀病毒感染、新變異型克雅病、H7N9 禽流感等新發感染性疾病不斷出現。而HIV、多重或廣譜耐藥的結核分枝桿菌、沙眼支原體等經典感染性疾病病原體又死灰復燃或出現新的致病特征。各種新發和再發的感染性疾病、不易發現的多重感染以及不明病因的發熱等，都給人類健康帶來了巨大的威脅，因此，臨床上對感染性疾病診斷的準確性和時效性提出了更高的要求。

感染性疾病診斷現狀

　　快速、準確的診斷是有效治療、病情監測和控制疾病蔓延的重要前提。隨著分子檢測技術的不斷發展和完善，分子檢測在病原微生物感染診斷及治療監測上的臨床應用日益廣泛，已成為一些重要的感染性疾病的診斷和療效評價中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子檢測方法主要包括：基于PCR的電泳法、實時熒光定量PCR（QPCR）、數字PCR、基因芯片技術、測序技術（Sanger測序技術、焦磷酸測序技術、高通量測序技術）等。

　　在感染性疾病領域中，獲得病原體的活體（對于細菌、真菌、病毒而言，主要是培養陽性），是感染性疾病診斷的金標準，但病原體的體外培養耗時普遍較長，操作步驟繁瑣，且絕大多數病原體不可培養；免疫學方法（如補體結合試驗、中和試驗、酶聯免疫吸附實驗、免疫熒光法和酶標斑點免疫法等）操作簡單，但由于病原體種類繁多，已研發的抗原、抗體數量遠遠不能滿足市場需求；PCR 檢測具有極高的靈敏度和特異性，但無法完成高通量篩查，檢出率較低；基因芯片技術只能對已知的病原體基因組進行意向性篩查， 而無法檢測新的未知病原體。據統計，約70%的感染性疾病患者因傳統檢測方法無法確定病原體信息，不能得到及時有效地救治，從而使病情惡化。因此，快速、特異且高通量的病原體檢測方法，對有效診斷和及時防治感染性疾病具有重要的意義。

　　近年來快速發展的NGS技術因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設計，可直接對未知病原微生物進行檢測，打破了傳統微生物檢驗的局限性，在臨床微生物領域展現了廣闊的前景。

NGS 在臨床微生物檢測中的應用

　　1. 感染性疾病的病原體鑒定

　　傳統的病原微生物鑒定方法主要有涂片鏡檢、分離培養、生化反應和質譜等方法，但其存在周期長、過程復雜及靈敏度低等缺點，如分枝桿菌菌種鑒定需要長達30～40 d的時間，而一些苛養菌及病毒對培養條件要求極其苛刻，甚至不能培養。以PCR 為基礎的分子診斷技術解決了上述部分病原體鑒定的問題，但難以解決未知微生物的檢測難題未知微生物在未知核酸序列時無法設計引物，成為這類技術的最大障礙。NGS檢測則無需對病原體進行分離培養，也不依賴已知核酸序列，可直接對標本進行測序鑒別，大大節省了檢測時間，提高了診斷效率，在對未知物種及難以培養的病原體鑒定方面具有無可比擬的優勢。

　　NGS 在病原體鑒定方面的應用主要有2種形式 ， 即rRNA基因測序和全基因組測序（whole genome sequencing, WGS）。rRNA 基因測序在臨床上常用于細菌、真菌的鑒定，同時也是菌群分析的基礎。WGS與rRNA基因測序相比，可獲取的信息更加全面，適用于病毒鑒定。因大部分病毒不可培養，且高度變異，NGS 與 Sanger測序、基因芯片等法相比，效率更高，且無需設計特定探針，更適合用于復雜臨床標本中的病毒鑒定。

　　2. 病原體分型及流行溯源

　　病原體分型方法包括基因組重復序列擴增、隨 機擴增多態性 DNA、脈沖場凝膠電泳、多位點序列分型技術等。這些技術可檢測病原體的型別，但分辨率較低，對于相似或變異度極高的病原體如病 毒等則常無法區別，而 NGS則彌補了此項缺陷，其可檢測病原體全基因組序列，獲得全部遺傳信息，被認為是分辨率最高的病原體分型方法。近年來，隨著抗生素的不規范使用甚至濫用，使細菌耐藥情況日益突出，耐藥菌株在醫院內的暴發流行時有發生。因此，對流行細菌進行追蹤和溯源十分重要。在對耐藥菌等病原體進行分型的基礎上，判斷同源性遠近，分辨出不同的進化路線，可追蹤或預防流行性疾病的大暴發。

　　3. 病原體耐藥及毒力特征檢測

　　在抗生素和宿主免疫等多重因素的壓力下，病原體在毒力和耐藥方面均發生了相應改變。各種高毒力株及耐藥株的出現是導致感染性疾病發病率和病死率居高不下的重要原因。臨床上病原體耐藥及毒力特征的檢測常規采用體外藥物敏感性試驗、耐藥菌表型檢測或核酸擴增等方法。這些方法操作繁瑣，且較費時、費力。NGS 通量高、快速，在一次測序反應中即可獲得細菌整個基因組的耐藥、毒力等相關基因信息，同時還可對目的基因、基因定位、基因環境、質粒相關序列等開展全面研究，有助于揭示病原體毒力及耐藥機制，對臨床治療及指導用藥均具有重要意義。

　　4. 與人體疾病相關的微生態失衡宏基因組

　　宏基因組學（Metagenomics）以微生物生態群落中所有微生物的基因組為研究對象，通過研究群落中物種組成和功能組成、同一個群體內不同微生物的相互作用、微生物群落與宿主之間的相互作用，并進行不同表型的樣品比較、分析，來解釋生物學 現象。近年來，NGS 技術越來越廣泛地被應用于腸道微生物領域的宏基因組學研究。多項研究表明，腸道菌群與宿主共生并共進化的過程中，在營養、代謝及免疫等多個方面影響著人體健康。腸道微生態失衡與人體多種疾病，如感染性疾病、肥胖癥、糖尿病、肝病、冠心病及腫瘤等之間存在密切關系。

　　腸道微生物宏基因組學研究則為研究腸道微生物與相關疾病的關系開辟了新途徑，是近年來研究的熱點。腸道微生物中關鍵功能菌更是有可能成為疾病診治的新型生物標志物和治療靶點。此外，病毒宏基因組測序直接以環境中所有病毒的遺傳物質為研究對象，可快速鑒定所有病毒組成，在對已知或未知病毒病原體的及時發現和動態監測等方面具有突出優勢，對病毒感染性疾病的防治有 重要意義。NGS因其測得數據量大、成本低、速度快的特點，無疑將成為研究腸道微生物和宏基因組學的有力工具。

NGS 在應用中面臨的挑戰

　　目前，NGS 技術常規應用于臨床病原學檢測仍存在很多實際問題:

　　病原體鑒定的準確度很大程度取決于分析的參考數據庫的范圍和完整性；

　　臨床標本的復雜性，可能使病原體信息太少而導致數據丟失或病原體數據混雜在正常菌群中難以區分；

　　NGS測序數據的解讀至關重要，測序的長度、數量、質以及試劑可能的細菌污染，均可影響病原體識別，導致標本中細菌多樣性估計過高；

　　目前尚未建立不同標本測序前處理和參數設置的統一規定，微生物 NGS測序質量評估、質量控制體系亦尚在建立中。

　　中國基因檢測行業市場快速發展，增長速度遠超全球水平，未來市場空間巨大，預計2020年將增長至378.8億元人民幣。我國作為人口大國，基因檢測行業已成為國家“精準醫學”戰略規劃的重要組成部分，發展前景廣闊，而病原微生物基因檢測的市場有更加廣闊的空間值得我們去開拓。