基因測序助力“液體活檢”大放異彩

　　2015年CSCO大會剛剛落下帷幕，精準醫療當仁不讓的成為吸引近2萬名與會者討論的熱門話題，而熱門中的熱門又當屬“液體活檢”。通過幾天的大會觀察發現，臨床專家幾乎是一邊倒的看好液體活檢在臨床中的應用，其在腫瘤早篩、腫瘤用藥、療效評估和復發監測方面的研究進展無不讓大家拍手叫好。本月24日，CellPress旗下的《TrendsInGenetics》刊發約稿文章《AccessingGeneticInformationwithLiquidBiopsies》，邀請多位國內外知名的轉化醫學研究專家為“液體活檢”的臨床應用把脈，作者包括中國工程院院士、中國協和醫科大學副校長詹啟敏教授，美國MDAndersonCancerCenter的FilipJanku教授，以及Illumina公司前資深技術總監、廣州基準醫療公司（AnchorDx）創始人范建兵博士和AnchorDx技術總監蔡緒雨博士。文章結合二代測序（NGS）技術最新進展，將注意力集中在“液體活檢”在未來分子診斷中的應用前景，同時也深刻的剖析了我們所面臨的挑戰。

　　在未來，哪種液體活檢樣本會脫穎而出？

　　前景有待證明的cfRNA/circulatingmiRNA：針對mRNA和miRNA的研究已持續多年，時而出現的幾篇重磅性文章一直使其處在大家視線之中。但現實又如何呢？一方面我們需要通過定量分析mRNAandmiRNA來診斷疾病；而在血液中，腫瘤細胞釋放的少量cfRNA很難準確檢出，因此實際應用在臨床的檢檢并不多。如果未來的技術可以實現高效富集疾病特異的外泌體或其他類型囊泡，它們的診斷價值也許可以得以體現。

　　前景不容樂觀的CTC：近兩年，循環腫瘤細胞（CTC）在國內的臨床應用呈快速上升的趨勢，應用較廣泛的是利用CTC數量評估部分癌種預后（FDA及CFDA批準的適應癥），同時也有學者嘗試根據CTC數量動態變化評估化療療效或改變治療策略，分離CTC進行體外藥敏試驗，或者基于NGS技術進行CTC單細胞測序，進而指導腫瘤個體化治療。但CTC在血液中的數量稀少（～1個CTC/10^9白細胞），陽性率低（晚期腫瘤患者＜85%)，腫瘤患者個體間CTC數量差異大。除（乳腺癌）預后評估，在療效評估方面的大型臨床試驗結果暫無陽性結果，比如2013年SABCS匯報的SWOGS0500臨床試驗就是一個失敗的例子。此外，CTC的臨床應用還有待于CTC捕獲技術和分析技術的雙重突破。

　　前景看好的cfDNA（cell-freeDNA)：外周血中游離的核酸小片段DNA源自正常細胞或腫瘤細胞代謝與凋亡，具有極大的臨床應用價值。其中臨床應用最為成功的是我們熟知的NIPT產品；它也是第一個基于NGS技術的臨檢產品，在靈敏度和特異性方面顯著優于常規產前篩查技術。腫瘤方面，多項研究顯示外周血中ctDNA（circulatingtumorDNA）的含量與腫瘤負荷及疾病進展相關；通過NGS對ctDNA進行定量分析，可以評估腫瘤大小，實現疾病實時監測。其次，在腫瘤早期篩查方面，多項研究證明ctDNA在腫瘤早期已經存在于外周血中，若與高靈敏度檢測技術結合，將有非常好的腫瘤早期篩查和殘留微病灶（MRD）檢測潛力。除此之外，利用ctDNA檢測腫瘤驅動基因，指導實時個體化治療是當下熱點。以肺癌為例，臨床中有30%以上的肺癌患者沒有足夠的腫瘤組織樣本可用來進行基因檢測，錯失靶向治療機會，而ctDNA正好彌補這一臨床缺口。有研究表明從晚期癌癥病人ctDNA與組織樣本中得到的檢測結果總體吻合率在80%左右，因而液體活檢已獲得臨床和相關機構認可，比如歐盟于2014年批準了阿斯利康易瑞沙（Iressa）血液ctDNA伴隨診斷，用于篩查受益人群。ctDNA還可以用來進行耐藥監測。隨著二代測序技術的快速發展，技術靈敏度和特異性不斷提高，最先借著風口，實現彎道超車的非ctDNA莫屬。

　　液體活檢走到臨床，還有哪些問題需要解決？

　　1，開發高靈敏度、高特異性檢測方法，包括技術平臺建設，實驗方法創新及大數據分析，實現對循環腫瘤細胞/cfNA的高效分離及準確的鑒定和分析。

　　基因突變、表觀遺傳學變化和基因差異表達是個體化診療的主要檢測目標。對應的檢測技術包括等位基因特異PCR、甲基特異PCR，芯片技術和NGS；其原理和技術參數均有不同。在臨床應用中，只有很好的將樣本類型與相關檢測技術相匹配才能獲得最優化的臨床產品。以體細胞基因突變檢測為例，外周血中ctDNA占總cfDNA的<0.1‰–>50%，這就要求應用液體活檢標本進行驅動基因檢測的技術和產品滿足至少兩個條件：1，高靈敏度、高特異性；2，可并行檢測體細胞基因單一位點突變、基因擴增和融合等多種突變類型，降低樣本用量。綜合分析當前常用技術不難發現，真正符合這一要求的技術并不多，如常用的等位基因特異PCR技術靈敏度在1-10%左右，可基本滿足腫瘤組織基因檢測的要求，但在基因突變豐度如此低的液體活檢樣本面前卻顯得束手無策；ddPCR技術靈敏度可以達到0.1‰，可以用于低豐度基因突變檢測，并已經成功應用于血漿EGFR檢測。但ddPCR只能對已知突變位點進行檢測，且不適用于融合基因。相比之下，NGS作為高通量的檢測技術優勢就顯得非常明顯；通過不斷的優化，已經出現靈敏度達到萬分之一的NGS檢測試劑盒。而且NGS可以同時檢測多種基因突變類型，包括體細胞突變、基因擴增和融合，可以對突變豐度低到0.02%的基因進行檢測，且特意性達到96%，因此非常適合對液體活檢進行基因檢測。

　　2，開展大規模臨床試驗（如針對疾病早診和監測）

　　不同于一般科學研究，任何臨床技術和產品在進入臨床應用前，必須經過相應的臨床研究或試驗來證明技術的安全性和產品的有效性。液體活檢進入臨床也必須通過這一途徑。

　　3，科學研究的最終目標是通過技術革命來改善人們的生活。目前，學術界和工業界正在努力將液體活檢的臨床應用價值融入大眾對健康和疾病的觀念中，將液體活檢的臨床應用落實到與人們生活息息相關的實處。

　　與二代測序技術結合后，液體活檢正在逐步成為分子診斷中不可或缺的一部分，并快速進入臨床，滲透到產前診斷，腫瘤治療，器官移植，心血管疾病和神經退行性疾病等多個領域。可以相信，隨著二代測序等高通量，高靈敏度和高準確性的技術的快速發展，分子水平的“液體活檢”必將在精準醫療臨床應用中發揮越來越重要的作用。