基因測序讓“孤兒病”不再孤獨無依

　　罕見病又稱“孤兒病”，由于單病種人群發病率低、病例分散等特點，長久以來罕見病研究處于醫學研究的荒漠地帶，未能引起臨床醫生的足夠重視，導致許多罕見病患者不得不面臨無法獲得明確、及時的診斷亦或即使診斷明確卻無藥可醫的兩難境地。解決罕見病患者診斷難、治療難的問題不僅是現代醫學面臨的重大挑戰，也是社會發展提出的迫切需求。隨著醫學研究的進步和社會經濟的發展，罕見病作為一組特殊疾病引起了研究者和臨床工作者的廣泛關注。目前，已知的罕見病已超過7000種，其中大部分罕見病與遺傳相關，其中約80%是由先天性遺傳缺陷引起的，且幾乎所有的單基因遺傳病均屬罕見病。

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　　多數罕見病存在異質性，包括遺傳異質性和臨床異質性，其中遺傳異質性又包含座位異質性和等位基因異質性。基因座位上通常含有1個以上的突變等位基因，由這多個不同等位基因引起的表型差異為等位基因異質性。這樣的表型差異可以是臨床上截然不同的兩種病，也可以是表型難以區分的兩種疾病。傳統的罕見病致病基因研究主要采用連鎖分析、定位克隆以及候選基因測序等方法，十分耗時耗力。近年來基因測序技術的不斷成熟以及使用成本的降低，使其在大規模人群中的運用逐漸成為現實。目前基因測序技術越來越多被應用于科學研究和臨床診斷中。在人們所發布的四代技術中，NGS更為廣泛的運用在罕見病診斷中，因此本文著重介紹NGS平臺在罕見病診斷中發揮的作用。

NGS技術發現罕見病新致病基因

　　遺傳性突變引起的罕見病

　　2009年9月Ng等在Nature雜志上發表了第一篇利用全外顯子組測序研究遺傳性疾病的方法學文章，利用安捷倫定制芯片捕獲外顯子和Illumina GAIIx平臺對4名無親緣關系的Freeman -Sheldon綜合征患者進行外顯子組高通量測序，準確的找出了位于MYH13基因中的突變，證實了FSS是一種由MYH3基因突變引起的常染色體顯性遺傳病證，首次證明了NGS方法在鑒定罕見病致病突變基因的準確性和可行性。隨后，該團隊又首次成功地從4例散發和家系（其中有1對同胞）未知病因的Miller綜合征鑒定出單個候選突變基因 DHODH，并證實此基因編碼嘧啶合成中一個關鍵的酶。

　　Kufs病（Kufs disease， KD）是一種罕見的成人型神經元蠟樣脂褐質沉積癥（neuronal ceroid lipofuscinosis， NCL）。根據受累個體的臨床癥狀分為2類 ：A型表現為進展性肌陣攣癲癇和認知功能減退，B型表現為運動、行為學功能異常和癡呆。診斷Kufs病具有一定的挑戰性，其癥狀表現與多種疾病相似，病理診斷可能需要腦組織活檢。2011年，Nosková等在家系連鎖分析、拷貝數變異和基因表達譜芯片分析基礎上，使用外顯子組測序和候選基因PCR擴增Sanger測序分析，在20個常染色體顯性遺傳KD受累家庭中，發現了位于DNAJC5基因上的c.346_348delCTC密碼子缺失和c.344T>G 雜合子突變，該突變導致p.Leu116del缺失和p.Leu115Arg氨基酸改變。美國華盛頓大學醫學院和美國紐約州國立發育障礙基礎研究所研究人員也分別通過家系分析，利用安捷倫SureSelect 人50 Mb外顯子組試劑盒、Illumina HiSeq 2000平臺和候選基因Sanger測序分析發現了上述突變。目前確認CLN6基因突變可導致常染色體隱性遺傳A型KD，DNAJC5基因突變可導致常染色體顯性遺傳A型KD，CTSF基因突變可導致常染色體隱性遺傳B型KD。

　　非遺傳性突變引起的罕見病

　　2010 年，Hoischen等首次證明利用外顯子組測序可有效發現罕見病Denovo突變。他們利用安捷倫SureSelect外顯子捕獲試劑盒和Life Technologies SOLiD平臺對4例Schinzel-Giedion綜合征散發嬰兒進行外顯子測序分析，發現所有4個病例都存在SETBP1 基因雜合突變。他們又利用Sanger測序對嬰兒父母的SETBP1基因進行驗證，發現并無突變存在，暗示Schinzel-Giedion是一種由Denovo突變引起的顯性罕見病。同樣，對9例臨床診斷為Schinzel-Giedion綜合征患者Sanger測序，8例具有SETBP1基因的突變并且所有突變都發生在11 bp內，暗示該突變有著顯負性作用或功能獲得的作用。

　　2013 年，Shirley等在NEJM雜志上發表了一篇關于斯特奇-韋伯綜合征（Sturge-Webersyndrome）的文章，證實GNAQ基因上的體細胞嵌合突變導致了斯特奇-韋伯綜合征和葡萄酒色素痣（port-wine stains） 的發病。該團隊首先利用Illumina Hiseq 2000平臺對3名腦面血管瘤病患者的受累組織和正常組織進行了全基因組測序分析，找到1294個體細胞突變，通過與正常組織比對及VASST分析，最終確定患者染色體9q21的GNAQ基因發生了錯義突變。

　　近幾年，通過新一代測序技術發現的罕見病基因種類和數目呈快速上升趨勢，包括了線粒體疾病、神經系統疾病、代謝疾病、血液疾病、心血管疾病、皮膚疾病、耳鼻喉科疾病、眼科疾病和胃腸道疾病等類別，涉及60多種罕見病。

NGS技術在國內應用進展

　　在中國，基因測序技術在罕見病診斷中逐漸發揮重要作用。華大基因作為國內最早一批開始運用基因測序技術的機構，其在臨床診斷中的實力不可忽視。下面小編將介紹華大集團利用基因測序儀在臨床診斷罕見病的若干實例。

　　輔助臨床診斷

　　隨著高通量測序技術的不斷完善和生物信息學技術的高速發展，臨床表型輔以分子診斷結果，可對遺傳性疾病做出更為準確的診斷，尤其是對于那些臨床診斷困準的罕見病具有重要意義，可大大縮減罕見病確診的周期。例如，2014年9月，13個月齡女嬰，足月順產，出生時體質量2.85 kg，身高50 cm，而現體質量約2.9 kg，身高60 cm，臨床表現為:喂養困難，牙齒缺失，全身脂肪含量極低，雙手蜷縮，骨骼疑似變形，運動發育遲媛，坐立、翻身、行走均不能。其母否認妊娠期有任何異常，否認有任何家族病史，并稱女嬰曾就診于北京、廣州、湖南、深圳等多家醫院，病因不明。華大基因對此女嬰（Ⅱ-2）進行了全外顯子測序，通過基因組數據深入地分析與查找，結果，在與 Costello綜合征（OMIM#:218040）相關的HRAS基因上檢出一個雜合的已知致病突變:c.34G>T（pGly12Cys）；經過家系驗證，女嬰父母（I-1、I-2）及哥哥（Ⅱ-1）均未攜帯此突變，臨床表型均正常，即為新發突變，提示該家系2代中有1例患者一一女嬰因新發突變致病。Costello綜合征為顯性遺傳病，雜合的有害突變即滿足遺傳模式，因此HRAS基因的雜合突變c.34G>T（p.Gly12Cys）應為女嬰的致病原因。

　　表型重疊疾病準確分型

　　許多遺傳病具有臨床異質性，且部分疾病臨床表型相互重疊或表型不典型，使得臨床醫生在進行鑒別診斷時困準重重。基因檢測能夠從分子層面找到致病源頭，輔助臨床醫生鑒別診斷甚至糾正臨床上的“錯誤診斷”。例如，2014年2月，孫先生，40歲，因近兩年雙下肢肌肉漸進性無力及萎縮而就診。給孫先生進行的輔助檢查提示肌酸激酶（creatine kinase， CK）值為4212.3U?L，肌電圖檢查結果顯示為肌源性損害，醫生診斷孫先生為疑似貝氏進行性肌營養不良（BMD）。基于臨床診斷，孫先生在華大基因做了貝氏進行性肌營養不良相關的杜氏進行性肌營養不良（DMD）基因檢測，但檢測結果為陰性。

　　華大基因遺傳專家重新對孫先生的臨床表型進行了評估，明確其為進行性肌營養不良患者。通過對孫先生做了進行性肌營養不良相關31個基因的檢測，結果顯示，在導致肢帶型肌營養不良2B型的DYSF基因上檢出2個剪切突變c.144+1G>A和c342+1G>T，疑為致病突變。依據此基因檢測結果，醫生重新修正了之前的臨床診斷，也為孫先生找到了致病原因。

　　個體化診療指導

　　個體化診療主要是指利用個體基因型或基因表達譜信息在分子水平上輔助臨床做出診斷，從而增加診斷的準確性，井根據患者的遺傳特征選擇合適的治療方案。針對由不同的基因突變引起的同一種疾病或同一類表型，其相應的治療方案可能相差甚遠。

　　例如，2014年8月，某兒童醫院，女嬰，剛滿月因體檢發現血糖高達27.3 mmol/ L而就診。醫生懷疑其可能患有罕見的新生兒糖尿病，但臨床無法確診。華大基因為女嬰進行了單基因糖尿病相關基因集檢測并進行分型，結果顯示在KCNJ11基因上檢出一個已知致病的突變c.341G>A。該基因突變可導致β細胞ATP敏感性鉀通道關閉異常，進而使胰島素分泌不足，導致糖尿病的發生。有研究表明，因磺胺類藥物可以通過獨立的途徑來關閉ATP敏感性鉀通道，促進胰島素分泌，所以，KCNJ11基因突變所致PNDM長期治療時，嘗試用磺胺類藥物替代胰島素治療，能獲得更好的療效和生活質量。因此，基因檢測找到了受檢者的病因，驗證了醫生的疑似診斷，同時也為醫生給受檢者進行個體化治療，提供了分子遺傳學參考依據。

展望

　　綜上所述，NGS技術正逐步廣泛應用于軍見病的臨床分子診療，并發揮了極大的技術優勢，逐步獲得醫學界的廣泛認可，但仍然存在許多諸如法律法規、倫理、質量控制等方面的問題亟需探討解決，這其中最棘手的問題主要在于變異位點的解析。高通量測序結果會產生龐大的數據量，但相較而言，目前人類基因組變異與臨床表型間對應關系的研究仍存在很大的局限性，如何從海量的數據中準確找到有意義的位點，使之能有效的應用于臨床診療，這對科研人員是一個巨大的挑戰。

　　盡管存在挑戰，高通量測序為罕見病的臨床診斷和個性化治療帶來了前所未有的機遇。相信隨著對罕見病研究的不斷深入、高通量測序技術的不斷發展、變異數據庫的建立以及相關法律法規的完善，高通量測序技術在罕見病臨床分子診療領域的應用將逐步普及。

后記

　　經過數周的資料查找，小編了解了精準醫療所含內容包羅萬象，舉一千從，不僅僅是前文提到的質譜和基因測序，波譜（MRI等）、光譜（激光共聚焦等）等技術都為精準醫療的發展做出了重大貢獻。鑒于小編能力有限，無法為眾網友提供全面、有深度的內容。在這里，小編想說，朝聞道，遨游四海，尋有識之士，希望您為我們提供更全面、更有深度的內容，讓我們共同推進實現你我的健康中國夢而努力。