基因編輯技術給植物基因結構變異研究帶來新機遇

　　植物基因組結構變異（Structural variations, SVs）包括基因插入/缺失變異和拷貝數變異，與單核苷酸多態性和表觀遺傳差異一起構成種內和種間可遺傳表型的多樣性。了解SVs在植物表型變異中的作用對于植物育種工作者生產改良品種具有重要意義。但早期基因技術的低分辨率和低效的方法限制了研究人員對植物SVs的理解。隨著基因組檢測技術的迅速發展，使得以更高的分辨率和準確性評估SVs成為可能。

　　近日，澳大利亞科研人員在國際學術期刊Plant Biotechnology Journal上在線發表了題為“Current status of structural variation studies in plants”的綜述。該綜述總結了植物SVs的研究現狀，探討了SVs在表型性狀中的作用，比較目前技術在SVs研究中的優勢，并對SVs研究的未來挑戰進行了評估。

　　在早期的植物基因組研究中，由于技術的限制和高質量參考基因組的缺乏阻礙了植物中SVs的全面研究。許多植物具有龐大且復雜的基因組，多達80%的植物物種發生多倍體變化，這使得在植物基因組中鑒定SVs成為一個挑戰。基因組技術的最新進展，特別是長讀長測序和全基因組作圖，有望得到高質量的植物基因組和泛基因組組裝體，并獲得廣泛的SVs，以評估其在植物表型變異中的潛在作用。

　　在廣泛使用分子標記和DNA測序之前，SVs通過顯微鏡在核型水平上進行表征鑒定（圖1A）。然而，由于顯微觀察的分辨率和效率低下，目前利用顯微技術對SVs進行的研究很少，主要應用于確認已知的SVs。隨后基于雜交的微陣列方法的出現使得以比顯微鏡方法更高的分辨率和更低的成本進行SVs研究成為可能，兩種常用的方法是陣列比較基因組雜交（Array Comparative Genomic Hybridization, array-CGH）和SNP陣列。array-CGH可以有效地檢測多個基因組位點的拷貝數變化（Copy Number Variation, CNVs）（圖1B），并已應用于多種研究，包括基因發現、表觀遺傳修飾和染色質構象。盡管如此，array-CGH依舊無法檢測DNA片段的相互易位和倒位或絕對拷貝數。此外，array-CGH是專門為二倍體個體設計的，對較高的倍性（>2組染色體）不敏感。與array-CGH相比，SNP陣列對等位基因特異性CNVs更為敏感（圖1C），但SNP陣列提供的信噪比較差。與array-CGH一樣，SNP數組不能用于檢測插入。

　　過去，由于植物基因組的讀取長度短、重復性和復雜性，據報告，多達89%的SVs為假陽性，需要進行全面過濾以確保穩健結果。近年來，長讀長測序和高通量染色體構象捕獲（Hi-C）技術的發展為克服短序列讀取帶來的一些問題提供了解決方案。Hi-C可以物理上跨越整個染色體，并用于檢測大規模SVs，而長讀長測序包括合成長讀取測序和單分子長讀取測序，平均長度可以達到10到100 kb，以解析無法通過短讀序列進行分析的SVs。并且隨著成本的降低以及測序技術和算法的不斷進步，產生了更精確的數據（準確度>99%），如PacBio HiFi讀數和Oxford Nanopore R10.3，這可以進一步提高基因組分析的準確度，尤其是單倍型基因組組裝和SVs研究。納米通道中的光學映射是對DNA測序的補充，為大規模SVs檢測提供了更簡便的途徑（圖1D）。高質量基因組組裝的不斷增加，使植物SVs特征化更為可靠。

　　圖1 從過去到現在用于識別SVs的方法。

　　A. 顯微鏡觀察、B. 比較基因組雜交、C. SNP陣列、D. DNA測序鑒定SVs

　　隨著DNA測序和光學作圖的升級以及生物信息學工具的發展，植物中SVs的研究變得越來越普遍，人們越來越意識到SVs與SNPs和小分子標記一樣重要。盡管目前的技術和方法大大提高了SVs識別的分辨率，但假陽性仍然存在。為了使SVs檢測更加可靠，需要進行過濾和進一步驗證。機器學習方法可以用來集成來自不同算法的SVs，以減少誤報。隨著長讀長測序的準確性和長度的提高，將支持對等位基因或雜合子變異以及當前線性裝配中缺失的隱藏基因的挖掘。

　　挖掘SVs或被SVs改變的基因對育種工作有重要意義。目前，很少有直接將SVs與特定表型聯系起來的方法，因此需要SVs全基因組關聯研究方法來有效地將SVs與表型聯系起來。利用CRISPR/Cas系統進行基因組編輯提供了一種驗證SVs的方法。為了進一步促進植物育種，需要建立不同物種的SVs表型相關數據庫，通過搜索數據庫確定候選SVs，將這些SVs用于育種以創制改良品種。