多年磨一劍！韓春雨團隊等溫PCR平臺新突破

　　Argonaute促進的靶向是一種酶介導的、高保真的、高效的堿基配對過程，可以重新用于升級PCR技術。來自嗜熱Caloramator sp.（CalAgo）的Argonaute蛋白在65°C的Tte-UvrD解旋酶存在下切割靶dsDNA，表明dmCalAgo（一種核酸酶失活突變體）在相同條件下與靶dsDNA結合。

　　2025年4月22日，杭州微編生物科技有限公司韓春雨、高峰共同通訊在bioRxiv在線發表題為“Introducing An Argonaute-facilitated Isothermal Amplification Technology”的研究論文，該研究通過dmCalAgo、Tte-UvrD解旋酶和Bst DNA聚合酶的協同作用設計了一個Argonaute促進的等溫PCR平臺（等溫Ago-PCR）。

　　等溫Ago-PCR在65°C下實現了模板的擴增。升級在于用Argonaute促進的靶向取代引物退火。因此，等溫Ago-PCR不僅消除了對復雜引物設計和精密儀器的依賴，而且實現了高保真和高效的擴增。該平臺能夠在30分鐘內檢測到低拷貝模板（每個反應僅3個拷貝），實現了與qPCR相當的靈敏度，同時展示了優異的擴增動力學。該平臺還展示了與常見熱維護工具的兼容性。因此，等溫Ago-PCR有可能取代qPCR，具有廣泛的適用性。

　　該研究通過DNA引導的DNA pAgos（包括TtAgo、NgAgo和CbAgo）的比較序列分析，從嗜熱細菌Caloramator sp.ALD01（NCBI序列ID:WP_027308646.1）中篩選出Argonaute蛋白，并將其命名為CalAgo[1,2]。體外切割試驗表明，CalAgo具有DNA引導的內切酶活性，而dmCalAgo（一種核酸酶失活突變體）消除了可檢測的內切酶能力。此外，研究人員系統地表征了CalAgo的酶學性質。就二價金屬陽離子依賴性而言，CalAgo在Mg2?存在下表現出切割活性?, Mn2?, Co2?,或Ca2?,觀察到Mg2?的最佳效率? Mn2?。

等溫Ago-PCR的理論工作模型（圖源自bioRxiv）

　　在Tte-UvrD解旋酶存在的情況下，CalAgo表現出強大的dsDNA切割活性。這種協同效應可能源于解旋酶介導的dsDNA解旋到瞬時ssDNA區域，隨后允許CalAgo/gDNA復合物進行序列特異性結合和切割。因此，這種協同效應可以重新用于等溫放大中的退火升級。通過將切割缺陷的dmCalAgo突變體和Tte-UvrD解旋酶與鏈置換DNA聚合酶（如Bst-LF）結合，提出了一種Argonaute促進的等溫擴增平臺，稱為等溫Ago-PCR。

　　該研究表明，等溫Ago-PCR平臺對M13mp18模板顯示出強大的擴增效率，凝膠電泳分析中清晰的產物積累證明了這一點。此外，等溫Ago-PCR在環狀ssDNA、線性dsDNA和質粒中也實現了相當的擴增效率，顯示出廣泛的模板多樣性。對等溫Ago-PCR和常規qPCR之間的靈敏度和擴增動力學進行的基準分析顯示，前者具有顯著的性能優勢。定量評估表明，等溫Ago-PCR的靈敏度（每個反應3個拷貝）與qPCR相當，反應動力學顯著加速。關鍵的是，等溫Ago-PCR僅使用常見的熱維護工具就實現了低拷貝靶標（每個反應<10個拷貝）的靈敏檢測。這些流線型硬件要求將平臺定位為現場可部署的護理點診斷解決方案。

　　參考信息：

　　https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.04.21.649904v1