大蒜幼苗葉片mRNA的制備

實驗概要

本實驗以大蒜為試材介紹了mRNA制備的制備方法。

主要試劑

Trizol試劑，酚仿混合液(1: 1)，異丙醇，70%乙醇，RNase-free水，OBB緩沖液，Oligotex凝膠懸浮液，OEB溶液，OW2 buffer，3 M NaAc

主要設備

高速離心機，1.5 ml離心管，電泳儀，電泳槽，渦旋器，水浴鍋

實驗材料

大蒜(Allium Sativum L.)

實驗步驟

1. 植物總RNA的提取；

    1) 取100 mg植物材料，于液氮中研磨至粉狀，加入1 ml Trizol試劑，上下顛倒數次；

    2) 12000轉/min離心5分鐘，取上清；

    3) 酚仿混合液(1: 1)抽提兩遍，離心取上清；

    4) 加入1體積的異丙淳，沉淀5分鐘；

    5) 12000轉/min于4℃離心5分鐘，去上清；

    6) 70%乙醇洗沉淀兩遍；

    7) 室溫下干燥10分鐘；

    8) 沉淀溶于20 ul，電泳檢測。

2. mRNA的純化

    1) 于1.5 ml離心管中加入250-500 ug總RNA，60℃加熱3 min；

    2) 加RNase-free水，漩渦混合5 sec；

    3) 加500 ul OBB緩沖液，30 ul Oligotex凝膠懸浮液，混勻，70℃保溫3 min；

    4) 室溫放置不超過30 min；

    5) 15 000 X g離心3 min，去上清液；

    6) 加400 ul OW2 buffer懸浮沉淀；

    7) 轉移至small spin column中，15 000 X g離心2 min，棄收集液；

    8) 再加400 ul OW2 buffer于small spin column中，15 000 X g離心2 min；

    9) 轉移small spin column至一新的RNase-free的1.5 ml離心管中，加50 ul 70℃的OEB溶液，懸浮凝膠。15 000 X g離心2 min。

3. mRNA的濃縮

    1) mRNA溶液中加入1/10體積的3 M NaAc，2倍體積的乙醇。-20℃下放置1 hr；

    2) 8 000 X g離心15 min，棄上清；

    3) 沉淀中加1 ml 70%乙醇，混勻后8 000 X g離心15 min，棄上清；

    4) 將沉淀在空氣中干燥10 min，用適量RNase-free水溶解。