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  • 發布時間:2020-09-15 11:32 原文鏈接: 大鼠骨髓原代培養用于生產MSCs

    試劑和材料:

    1. 完全培養基(CCM):α-MEM:α-低限量基礎培養基,含谷氨酰胺,無核苷酸或脫氧核苷酸;添加:20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經F雜交瘤純化,非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。含0.2μg/ml兩性霉素B。過濾除菌。儲存于4℃,不超過2周;

    2.A;

    3.塑料組織培養Petri培養皿,15cm直徑;

    4.聚丙烯離心管,15ml和50ml;

    5.0.85%臺盼藍鹽溶液;

    6.改良的Neubauer血細胞計數器;

    7.Eendorf 5417C微量離心器或同等設備;

    實驗方法:

    1. 從一根股骨所得的骨髓懸液中取出10μl,與10μl臺盼藍混合,評估存活率,確保高于80%;

    2.1000g離心10min沉淀骨髓;

    3.用25ml預熱的含抗真菌藥物的CCM重懸骨髓(處理大鼠骨髓細胞使用抗真菌藥物,人骨髓細胞不使用);

    4.將25ml細胞懸液加入到15ml直徑的組織培養板中,37℃,5%CO2環境下至少孵育15h;

    5.從培養箱中取出培養板,吸出培養基;

    6.用20ml預熱的A潤洗單層細胞。重復潤洗過程3次,將最后的洗滌產物加入30ml預熱的含抗菌藥物的新鮮CCM中(只有大鼠細胞使用抗真菌藥物);

    7.如有需要每隔兩天重復步驟6,維持6—14天;

    8.每3天用倒置顯微鏡觀察單層細胞。貼壁、成纖維細胞樣的MSCs集落可以在培養板中清洗可見。某些情況下,這可能是造成細胞污染的信號,但這些細胞隨著細胞傳代過程可被去除。當培養物達到40%—50%匯合時,按照MSCs自我更新的集落形成單位測定的方法處理細胞。這些MSCs標記為0代。

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