如何提取mrna

1 細胞總RNA的提取
1）、6孔板細胞（CNE-2）匯合度為90-100%時,取出無菌室,去其上清,用PBS洗兩次后,每孔加TRIZOL試劑（Gibco公司） 1 ml,搖勻,無菌罩內消化3-5分鐘（觀察：液體變粘稠,細胞脫壁）.
2）、將各孔內消化好的細胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5 ml EP管中,加新開的氯仿0.2 ml,輕搖15秒.
3）、室溫靜置2-3分鐘后,12000 rpm,15 min,4℃,離心.然后取上清無色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過）,加0.5 ml新開的異丙醇,室溫下靜置10分鐘.
4）、12000 rpm,10分鐘,4℃,離心.觀察總RNA在管底的白色沉淀,棄去上清（小心別丟了沉淀）,75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后,7500 rpm,5 min,4℃離心.
5）、去上清,點離,用小Tip吸干液體.氣干沉淀5-10分鐘,DEPC處理水20-30 ul加入,中槍打勻,55-60℃水浴10分鐘溶解總RNA,測OD值.
6）、電泳.
2 從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022,QIAGEN）
1）、取上述提取的總RNA若干（少于0.25 mg）到一個新的無RNase 的EP管中,用無RNase的水定容到250 ul.
2）、加入Buffer OBB 250 ul,Oligotex Suspension 15 ul.用Tip打勻或用手彈勻.
3）、70℃水浴,3分鐘（裂解RNA的二級結構）.
4）、20-30℃條件下,靜置10分鐘（讓Oligotex與mRNA結合）.
5）、高速離心2分鐘,小心吸走上清（該上清要保留）,留下約50 ul的上清在原管里.
6）、用Buffer OW2 400 ul重懸含Oligotex/mRNA復合物的沉淀,然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速離心1分鐘.
7）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速離心1分鐘,丟掉濾過液.
8）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上,加20-100 ul熱的（70℃）Buffer OEB到柱子上,用Tip來回吸打3-4次,高速離心1分鐘.
9）、為保證最大的 mRNA產量,可再次重復第8步.
10）、電泳.
RNA提取的原理就是核酸在異丙醇中的溶解度很低!其他步驟都是防止RNA降解和使RNA從細胞中溶出.
逆轉錄過程請看參考資料.