如何構建分析方法

　　小編在后臺收到不少關于建樹的問題，今天轉載一篇PLoB的帖子，分享給大家，一起來看一下吧~

　　 方法的選擇

　　首先是方法的選擇。

　　基于距離的方法有UPGMA、ME（Minimum Evolution，最小進化法）和NJ（Neighbor-Joining，鄰接法）等。其他的幾種方法包括MP（Maximum parsimony，最大簡約法）、ML（Maximum likelihood，最大似然法）以及貝葉斯（Bayesian）推斷等方法。其中UPGMA法已經較少使用。

　　一般來講，如果模型合適，ML的效果較好。對近緣序列，有人喜歡MP，因為用的假設最少。MP一般不用在遠緣序列上，這時一般用NJ或ML。對相似度很低的序列，NJ往往出現Long-branch attraction（LBA，長枝吸引現象），有時嚴重干擾進化樹的構建。貝葉斯的方法則太慢。對于各種方法構建分子進化樹的準確性，一篇綜述（Hall BG. Mol Biol Evol 2005, 22(3):792-802）認為貝葉斯的方法最好，其次是ML，然后是MP。其實如果序列的相似性較高，各種方法都會得到不錯的結果，模型間的差別也不大。

　　對于NJ和ML，是需要選擇模型的。對于各種模型之間的理論上的區別，這里不作深入的探討，可以參看Nei的書。對于蛋白質序列以及DNA序列，兩者模型的選擇是不同的。以作者的經驗來說，對于蛋白質的序列，一般選擇Poisson Correction（泊松修正）這一模型。而對于核酸序列，一般選擇Kimura 2-parameter（Kimura-2參數）模型。如果對各種模型的理解并不深入，作者并不推薦初學者使用其他復雜的模型。

　　Bootstrap幾乎是一個必須的選項。一般Bootstrap的值>70，則認為構建的進化樹較為可靠。如果Bootstrap的值太低，則有可能進化樹的拓撲結構有錯誤，進化樹是不可靠的。

　　對于進化樹的構建，如果對理論的了解并不深入，作者推薦使用缺省的參數。需要選擇模型的時候（例如用NJ或者ML建樹），對于蛋白序列使用Poisson Correction模型，對于核酸序列使用Kimura-2參數模型。另外需要做Bootstrap檢驗，當Bootstrap值過低時，所構建的進化樹其拓撲結構可能存在問題。并且，一般推薦用兩種不同的方法構建進化樹，如果所得到的進化樹類似，則結果較為可靠。

　　 軟件的選擇

表1 一些與構建分子進化樹相關的軟件

　　構建NJ樹，可以用PHYLIP（寫得有點問題，例如比較慢，并且Bootstrap檢驗不方便）或者MEGA。MEGA是Nei開發的方法并設計的圖形化的軟件，使用非常方便。作者推薦MEGA軟件為初學者的首選。雖然多雪列比對工具ClustalW/X自帶了一個NJ的建樹程序，但是該程序只有p-distance模型，而且構建的樹不夠準確，一般不用來構建進化樹。

　　構建MP樹，最好的工具是PAUP，但該程序屬于商業軟件，并不對學術免費。因此，作者并不建議使用PAUP。而MEGA和PHYLIP也可以用來構建進化樹。這里，作者推薦使用MEGA來構建MP樹。理由是，MEGA是圖形化的軟件，使用方便，而PHYLIP則是命令行格式的軟件，使用較為繁瑣。對于近緣序列的進化樹構建，MP方法幾乎是最好的。

　　構建ML樹可以使用PHYML，速度最快。或者使用Tree-puzzle，速度也較快，并且該程序做蛋白質序列的進化樹效果比較好。而PAML則并不適合構建進化樹。

　　ML的模型選擇是看構出的樹的likelihood值，從參數少，簡單的模型試起，到likelihood值最大為止。ML也可以使用PAUP或者PHYLIP來構建。這里作者推薦的工具是BioEdit。BioEdit集成了一些PHYLIP的程序，用來構建進化樹。Tree-puzzle是另外一個不錯的選擇，不過該程序是命令行格式的，需要學習DOS命令。PHYML的不足之處是沒有win32的版本，只有適用于64位的版本，因此不推薦使用。值得注意的是，構建ML樹，不需要事先的多序列比對，而直接使用FASTA格式的序列即可。

　　貝葉斯的算法以MrBayes為代表，不過速度較慢。一般的進化樹分析中較少應用。由于該方法需要很多背景的知識，這里不作介紹。

　　需要注意的幾個問題是：

　　其一，如果對核酸序列進行分析，并且是CDS編碼區的核酸序列，一般需要將核酸序列分別先翻譯成氨基酸序列，進行比對，然后再對應到核酸序列上。這一流程可以通過MEGA 3.0以后的版本實現。MEGA3現在允許兩條核苷酸，先翻成蛋白序列比對之后再倒回去，做后續計算。

　　其二，無論是核酸序列還是蛋白序列，一般應當先做成FASTA格式。FASTA格式的序列，第一行由符號“>”開頭，后面跟著序列的名稱，可以自定義，例如user1，protein1等等。將所有的FASTA格式的序列存放在同一個文件中。文件的編輯可用Windows自帶的記事本工具，或者EditPlus（google搜索可得）來操作。

　　文件格式如圖1所示：

圖1 FASTA格式的序列

　　另外，構建NJ或者MP樹需要先將序列做多序列比對的處理。作者推薦使用ClustalX進行多序列比對的分析。多序列比對的結果有時需要后續處理并應用于文章中，這里作者推薦使用GeneDoc工具。而構建ML樹則不需要預先的多序列比對。

　　因此，作者推薦的軟件組合為：MEGA 3.1 + ClustalX + GeneDoc + BioEdit。

　　 數據分析及結果推斷

　　一般碰到的幾類問題是：

　　 推斷基因/蛋白的功能；

　　 基因/蛋白家族分類；

　　 計算基因分化的年代。

　　關于這方面的文獻非常多，這里作者僅做簡要的介紹。

　　推斷基因/蛋白的功能，一般先用BLAST工具搜索同一物種中與不同物種的同源序列，這包括直向同源物（ortholog）和旁系同源物（paralog）。如何界定這兩種同源物，網上有很多詳細的介紹，這里不作討論。然后得到這些同源物的序列，做成FASTA格式的文件。一般通過NJ構建進化樹，并且進行Bootstrap分析所得到的結果已足夠。如果序列近緣，可以再使用MP構建進化樹，進行比較。如果序列較遠源，則可以做ML樹比較。使用兩種方法得到的樹，如果差別不大，并且Bootstrap總體較高，則得到的進化樹較為可靠。

　　基因/蛋白家族分類。這方面可以細分為兩個問題。一是對一個大的家族進行分類，另一個就是將特定的一個或多個基因/蛋白定位到已知的大的家族上，看看屬于哪個亞家族。例如，對驅動蛋白（kinesin）超家族進行分類，屬于第一個問題。而假如得到一個新的驅動蛋白的序列，想分析該序列究竟屬于驅動蛋白超家族的14個亞家族中的哪一個，則屬于后一個問題。這里，一般不推薦使用MP的方法。大多數的基因/蛋白家族起源較早，序列分化程度較大，相互之間較為遠源。這里一般使用NJ、ME或者ML的方法。

　　計算基因分化的年代。這個一般需要知道物種的核苷酸替代率。常見物種的核苷酸替代率需要查找相關的文獻。這里不作過多的介紹。一般對于這樣的問題，序列多數是近緣的，選擇NJ或者MP即可。

　　如果使用MEGA進行分析，選項中有一項是“Gaps/Missing Data”，一般選擇“Pairwise Deletion”。其他多數的選項保持缺省的參數。

　　 總結

　　在實用中，只要方法、模型合理，建出的樹都有意義，可以任意選擇自己認為好一個。最重要的問題是：你需要解決什么樣的問題？如果分析的結果能夠解決你現有的問題，那么，這樣的分析足夠了。因此，在做進化分析前，可能需要很好的考慮一下自己的問題所在，這樣所作的分析才有針對性。

　　序列比對建議用ClustalX。

　　建NJ或MP樹，用MEGA就可以了，非常方便。

　　若要建ML樹推薦用phyML。

　　建Bayes樹推薦用Parallel MrBayes。