如何用qpcr計算轉基因植物拷貝數

鑒定轉基植物第步要確定轉基已經穩定整合染色體第二步任務評估少轉基拷貝及每轉基表達水平何般經游表達載體設計構建及游轉化體系建立、轉化品系篩選鑒定等系列步驟即獲 T 0 代轉基植物轉化程外源 DNA 隨機插入植物基組內插入拷貝數位點都固定插入外源基拷貝數低（1或2）能較表達插入拷貝數則導致表達穩定甚至基沉默現象檢測T0代轉基植物外源基拷貝數研究其特性基礎步驟

其原理待測 DNA 品固定固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）與標記核酸探針進行雜交與探針同源序列固相 DNA 位置顯示雜交信號通檢測信號、強弱品定性、定量計算轉入拷貝數Southern準確性高、特異性強存費費力缺點另外由于Southern檢測經靶片段擴增（PCR）般每電泳通道需要10-30 μgDNA實際操作需要較量植物材料提取DNA轉基植物愈傷組織菌條件經篩選、重新化般都比較細弱宜量取外源基插入發基重組造限制性酶切位點丟失Southern 檢測些素都制約SouthernT0代轉基植物檢測外源基拷貝數應用

2、熒光定量PCR

利用新型、靈敏、高通量實熒光定量PCR用于測定原始品系轉基絕拷貝數實熒光定量PCR技術種較新DNA定量其定量基本原理PCR反應體系加入非特異性熒光染料（：SYBR GREEN I）或特異性熒光探針（：Taqman 探針）實檢測熒光量變化獲同品達定熒光信號（閾值）所需循環數：CT值（Cycle Threshold）；通已知濃度標準品CT值與其濃度數繪制標準曲線準確定量品濃度熒光定量 PCR 技術具簡便、快捷優點能夠效擴增低拷貝靶片段DNA每克品20 pg-10 ng轉基進行效檢測同與Southern相比熒光定量PCR技術T-DNA 同序列進行擴增能實現轉基品系基重組檢測

選擇種合適陽性標準品繪制標準曲線應用實熒光定量 PCR 技術準確定量模板初始濃度基礎近內外科家做同嘗試Song（2002）等認理想標準品應該已插入外源基植物基組DNA并且用Southern blot準確測插入外源基拷貝數實際研究難套標準品提替代案根據外源基拷貝數野型植物基組 DNA 按定濃度比率混合制標準曲線例轉基玉米外源基拷貝數研究發現加入熒光染料SYBR GREEN I20 μL PCR反應體系應6 ng野型玉米基組DNA作模板量已知玉米基組DNA2.5 × 10.9 bp（ArmuganathanEarle 1999）相應于6 ng玉米基組DNA即計算模擬1、2、4、8、16外源基拷貝應加入質粒 DNA 量

些梯度混合液作標準品繪制標準曲線檢測品濃度并計算插入拷貝數實驗表明用種獲數據 Southern blot 結相致Giovanna（2002）農桿菌介導轉基番茄作研究材料選擇雙元載體T-DNA區兩外源基TSWV-N（Tomato spotted wilt virus）、nptⅡ（neomycin phosphoril-transferaseⅡ）單拷貝內源基（endogenous gene）作熒光定量PCR擴增模板檢測外源基拷貝數認使用植物基組 DNA 定比例質粒混合液作標準品累積許避免誤差比使用種標準品必需預先知道待測植物基組 DNA 精確量并植物基組 DNA 質粒準確定量數情況數據都近似值再混合液作標準品檢測每轉基植株外源基拷貝數放些誤差

提相CT或δ-δCT優點需要每實驗制作標準曲線需要優化步驟證明外源基與內源基相同至少相似反應效率即與其定量技術 Southern Blot 相比實定量 PCR 技術特異性高信嗓比特性轉基拷貝數定量提供些便與實定量 PCR 相比 DNA 點雜交技術要花費菲