庫DNA的大規模擴增實驗

非常長且復雜的庫經常需要若干毫升規模的 PCR 擴增。大規模 PCR 與常規 PCR的不同之處在于它一般在水浴中進行，而且需要使用 15 ml、17 mm×120 mm 的螺紋口蓋子的熱穩定管子（Sarstedt） 來容納更大的體積。高至 2.5 L 體積的擴增反應都曾用這種方法做過。中等規模的擴增有時可以在能容納多個樣品（如 96 孔 PCR 板）的熱循環器中進行。

純化的 ssDNA 庫和引物

EDTA 乙酸銨 1：1 （V V） 苯酚 氯仿 氯仿 乙醇 TE 緩沖液

熱循環器或三個水浴（其中之一必須是循環水浴） 96 孔 PCR 板或 13 ml 熱穩定管（Sarstedt） 溫度計 聚苯乙烯泡沫塑料架子 分光光度計或熒光計

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 在小規模水平鑒定出合適的 PCR 條件后，配制大規模反應所需的試劑。為大規模擴增留出時間，這往往需要一整天的時間。

如果大規模擴增反應的體積＜100 ml：

2a. 可以重復使用商品化的熱循環器。預先配制好反應混合物，然后按每份 100 ul 的體積分裝到 96 孔 PCR 板的每個孔中。

3a. 預先進行幾個小規模的擴增反應以確保輔助方案中優化的條件也適用于 PCR 板，而且擴增反應在整塊板上是一致的。

4a. 用 11 塊 PCR 板進行整個反應的熱循環過程。

對于更大的體積：

2b. 將溫度計插入盛有 10 ml 水的 Sarstedt 管中來制作一個溫度探針以確定反應混合物在管中需要多久才能達到熱平衡。將此探針與其他類似的管子放在架子上。

3b. 為確保反應條件能如計劃中的那樣確實發揮作用，在架子上放上分別裝有水、單獨的一個擴增反應體系和溫度探針的管子。將樣品變性 30 min， 然后在首次復性后加入 Taq 酶。每一循環都取出一小份以監測反應進程。

4b. 反應條件確證后，繼續下面的擴增反應。最后一步延伸要進行 20 min 以上以確保所有的模板都成為雙鏈。

5. 擴增結束后，將各個孔或管中的反應液富集到一起，加入 1 mol/L 等量的 EDTA， pH 8.0螯合掉緩沖液中的鎂離子。

6. 加入等體積的 2-丁醇進行抽提，將反應液濃縮到可操作的體積（通常為 10～20 倍）。渦旋振蕩混合各層，然后室溫下于 1200 g 離心 5 min， 棄上清-丁醇液層。如果需要可重復此步操作。

7. DNA 濃縮后，進行苯酚/氯仿抽提，隨后進行兩次氯仿抽提。

8. 需要的話可以在 13 ml Sarstedt 管中加入等體積的 4 mol/L 乙酸銨（終體積為 2 mol/L） 和兩倍體積的乙醇沉淀出 DNA。

9. 用 TE 緩沖液（pH 8.0，含 50 mmol/L 鹽，如氯化鉀）重懸擴增出的 DNA。

10. 定量測定 PCR 產出的 DNA。

11. 大規模擴增后，于 -80℃ 存儲至少 4 個拷貝的庫。

此處 x 為庫的總拷貝數，y 為得到的庫的拷貝數

如果將通過擴增而產生 8 個庫的拷貝中的 4 個存檔的話，那么約 99.6％ 的起始庫的復雜度將得以保存。同理，至少 4 個拷貝的庫應當用于實驗操作，如連接、轉錄或生物素化標記。這樣的話，初始的復雜度在用于實驗操作或合成的拷貝中也能得以體現。