異構酶的測定實驗

實驗方法原理

D-木糖 ? D-木酮糖

實驗材料 酶溶液

試劑、試劑盒 TES NaOHD-木糖MnSO4半胱氨酸·HCl咔唑溶液硫酸

儀器、耗材 分光光度計

實驗步驟

實驗所需「試劑」具體見「其他」

20 ul 的實驗混合物和 20 ul 酶溶液（各自用 20 ul TES 緩沖液作對照）混合，并在測定溫度（例 50℃）下緊靠反應容器放置 15 min，在用冰冷卻并加入 40 ul 半胱氨酸和 40 ul 咔唑溶液的情況下酶反應會停止，加入 1.2 ml 70％ 硫酸顏色開始變化，在室溫下放置 10 min 后對比參照，在 546 nm 處測吸光值。

注意事項

過任何時間顏色也不會達到一個恒定量，因此，每隔 10 min 必須非常仔細地觀察顏色的變化，在同樣的時間間隔后所有的樣品都被準確讀數。空白對照的吸光值應該大約是 0.2，如果吸光值接近 0.3 則測定反應物需重新配制。為了定量，需要準備木酮糖的校對曲線，木酮糖濃度應在 0～10 umol/L 之間。

其他

試劑：

0.2 mol/L TES/NaOH，pH 8.0［N-tris（羥甲基）-甲基-2-氨甲基酸，Mr＝229.3；9.2 g 溶于 100 ml 水中，用 1 mol/L NaOH 調節至 pH 8.0，用水加至 200 ml］

0.4 mol/L D-木糖（Mr＝150.1；1.2 g 溶于 20 ml 水中）

0.03 mol/L MnSO4（單水化合物，Mr＝169.0；57 mg 溶于 10 ml 水中）

1.5％ 半胱氨酸·HCl（半胱氨酸·HCl-水合物，Mr＝175.6；溶解 1.5 g 在 100 ml 水中）

0.12％ 咔唑溶液（Mr＝167.2；120 mg 溶于 100 ml 乙醇中）

70％ 硫酸