微生物學實驗室的主要儀器設備（二）

下面以普通光學顯微鏡為例，簡單介紹一下顯微鏡的結構、原理等。

1. 基本構造

普通光學顯微鏡由機械裝置和光學系統兩部分組成（如圖1.1）。機械裝置由鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、物鏡轉換器和調焦裝置（粗調焦螺旋和微調焦螺旋）等組成。光學系統包括物鏡、目鏡、聚光器、彩虹光闌和光源等。

2. 成像原理和性能

普通光學顯微鏡的成像原理如圖1.2所示。將被檢物體置于集光器和物鏡之間，平行的光線自反光鏡折入聚光器，光線經過聚光器穿過透明的物體進入物鏡后，即在目鏡的焦點平面（光闌部位或附近）上形成一個初生倒置的實像。從初生實像射過來的光線，經目鏡的接目透鏡而達到眼球。這時的光線已變為或接近平行光，再透過眼球的水晶體時，便在視網膜后形成一個直立的實像。

顯微鏡的主要性能包括放大率、工作距離、焦點距離、焦點深度、分辨率、鏡像亮度和視場亮度等。

（1）放大率

在顯微鏡組合中，光線通過物鏡先將物體放大為一個左右相反、前后倒置的實像，經目鏡再次放大為一個虛像，這一虛像的大小和物體大小的比例，就叫放大率。

顯微鏡的放大率 = 物鏡的放大倍數×目鏡的放大倍數

               = （光學筒長/ 物鏡焦距）×（明視距離/ 目鏡焦距）

明視距離是已知數，物鏡焦距和目鏡焦距在說明書上有數據可查，而光學筒長是指物鏡上焦平面到目鏡下焦平面的距離，一般為160mm。

（2）工作距離

當顯微鏡調準焦距時，從蓋玻片到物鏡前透鏡表面之間的距離叫工作距離。工作距離的大小和物鏡的放大倍數與數值口徑有關。物鏡放大倍數和數值口徑愈大，則工作距離愈小，反之愈大。表1.1表示標準物鏡的主要性質。一般油鏡的工作距離最短，約0.2mm。因此，要求蓋玻片的厚度為0.17~0.18mm。若蓋玻片過厚，就不可能將被檢體聚焦，且易引起物鏡的意外損壞。

表1.1標準物鏡的主要性質

（3）焦點距離（焦距）

它是指平行光線經過單一透鏡后集于一點，由這一點到透鏡中心的距離。一個物鏡通常有幾個不同性質的透鏡組成。因此，它的焦距的測定比較復雜。一般，顯微鏡的物鏡上都注明焦距的長度。物鏡的放大倍數越大，焦距越短。

（4）焦點深度

在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內，也可看清楚，這個清晰部分的厚度就是焦點深度。焦深與總放大率和數值口徑成反比，因此，高放大率和高數值口徑的顯微鏡其焦深就淺，不能看到標本的全厚度。必須調節螺旋仔細地從上到下進行觀察。另外，被檢物體周圍介質（封片劑）的折射率加大可增大焦深。尤其在顯微照相時，更應考慮封片劑的使用。

（5）數值口徑（numerical aperture 簡寫為NA）

數值口徑是指物鏡與標本間介質折射率（n）和光線投射到物鏡上的最大入射角（α）一半正弦的乘積。其計算公式為：

NA=n×sin(α/2)

其中，n=介質折射率，干燥系物鏡n=1，油浸系物鏡n=1.515；α=光線進入物鏡的最大夾角，也稱鏡口角。

（6）分辨率

顯微鏡能夠分辨物體結構中兩點之間的最小距離的能力，就叫分辨率。分辨率與物鏡的數值口徑成正比，與光波波長成反比。因此物鏡的數值口徑愈大，光波波長愈短，則顯微鏡的分辨率愈大，被檢物體的細微結構也愈明晰地區分出來。因此，一個高分辨率意味著一個小的分辨距離。顯微鏡的分辨率是用可分辨的最小距離（D）來表示的：

D=λ /（2NA）

（7）鏡像亮度與視野亮度

鏡像亮度是顯微鏡的圖像亮度的簡稱，指在顯微鏡下觀察到的圖像的明暗程度。使用時，對鏡像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不耀眼。鏡像亮度與數值口徑平方成正比，，與總放大倍數的平方成反比。

視場亮度是指顯微鏡下整個視場的明暗程度。視場亮度不僅與目鏡、物鏡有關，還直接受聚光鏡、光闌和光源等因素的影響。在不更換物鏡和目鏡的情況下，視場亮度大，鏡像亮度也大。

3. 油鏡的基本原理

油鏡，也稱油浸物鏡，一般在鏡頭上標有“HI”和“HO”字樣，或在鏡頭下緣刻有1~2道黑線作為標記。使用油鏡時，需將鏡頭浸在香柏油中進行觀察，這是為了消除光由一種介質進入另一種介質時發生散射，結果不僅提高了放大倍數，還增加了照明度和分辨率。

（1）照明亮度

油鏡與其它物鏡不同之處在于玻片和物鏡之間的介質不是空氣，而是一種和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）。如果玻片與物鏡之間的介質是空氣（n=1.00），光線通過玻片后發生散射，進入視場的光線顯然減少，結果降低了視場亮度。當光線通過玻片又通過香柏油進入物鏡就不發生散射，結果，提高了照明度，觀察的標本顯得更清晰（圖1.3）

（2）分辨率強

使用油鏡還能增加顯微鏡的分辨率。由于顯微鏡分辨率與物鏡的數值口徑（NA）成反比，與波長成正比。因此物鏡的數值口徑愈大，光波愈短，則顯微鏡的分辨率就愈大。人們肉眼所能感受的光波平均長度為0.55μm，加入數值口徑NA=0.65高倍物鏡，能分辨兩點之間的距離為0.42μm，而小于0.42μm的兩點之間距離就分辨不出，而使用數值口徑NA=1.25油鏡，能分辨兩點之間的最小距離為0.22μm。因為不論總放大倍數多大，用普通光學顯微鏡是無法觀察到小于0.2μm的物體，但大部分細菌直徑在0.5μm以上，故用油鏡就能清晰地觀察到細菌的個體形態。

4. 注意事項

使用顯微鏡應注意以下事項： 

（1）取拿顯微鏡時，必須用一手握住鏡臂，另一手托住顯微鏡的鏡座，使顯微鏡保持直立的狀態，切忌用單手提拿。 

（2）將顯微鏡放置桌上時，務必要輕輕放下。 

（3）顯微鏡的鏡頭必須保持清潔，必要時用擦鏡紙擦拭鏡頭，不可使用布或一般的紙，以免損傷鏡頭。 

（4）將顯微鏡輕輕地放置桌上，鏡座后緣位于離桌子邊緣約5cm處。 

（七）接種箱（Clean Box）

接種箱分為固體菌種接種箱和液體菌種接種箱兩種。固體菌種接種箱是一個用木料和玻璃制成或由有機玻璃焊接而成的密閉小箱。又分為雙人和單人操作箱。箱體可大可小，一般箱體長約143cm，寬86cm，總高154cm，支架76cm。箱的上部左右兩側各裝有兩扇能啟閉的玻璃推拉門，方便菌種進出。窗的下部分別設有兩個直徑約13cm的圓洞，兩洞的中心距離為52cm（同肩寬），洞口裝有帶松緊帶的袖套，以防雙手在箱內操作時，外界空氣進入箱內造成污染。操作時兩人相對而坐，雙手通過袖套伸入箱內。箱兩側最好也裝上玻璃，箱頂部為木板或玻璃。箱內頂部裝有紫外線殺菌燈和照明用日光燈各一支。箱體安裝木板或玻璃均可，但要注意密封。

液體菌種接種箱是專為移接液體菌種而設計的。比固體菌種箱窄長，單側兩人操作。內設軌道和紫外線燈，箱兩端開有高25cm，寬10cm的長方形出口，方便菌種進出，洞口設有小推門。進出口下處設蒸汽源，接種時用蒸汽封住進出口，以防雜菌進入箱內。箱背面設有液體菌種移接管能進入的小孔。

接種箱滅菌時，用紫外線照射30min。如果沒有紫外線燈，可用甲醛和高錳酸鉀（甲醛10～14mL/m³+高錳酸鉀5～7g/m³空間）熏蒸30min以上。使用時，先將所需物品和工具放入接種箱內，然后進行藥劑熏蒸和紫外線滅菌，再按無菌操作進行接種。

接種箱的結構簡單，造價低廉，易消毒滅菌，操作方便，而且人在箱外操作，氣溫較高時也能作業。缺點是進出培養基費工費時，每次接種前都需要進行滅菌。

（八）冰箱

微生物實驗室的冰箱主要有兩種：普通冰箱和低溫冷凍冰箱。普通冰箱一般都具有兩個柜子，即鮮藏柜和冷藏柜，溫度分別為4℃和－20℃；低溫冷凍冰箱溫度一般控制在－40～－80℃。它們都可以用于微生物菌種保藏。鮮藏柜常用于保存斜面菌種，保藏時間在3個月左右。超過3個月，斜面就會變干，因此需要轉接菌種。如果要長時間保存菌種，則需要經過處理后，貯藏于普通冰箱的冷藏柜或低溫冷凍冰箱中，它們的保藏時間較長，一般都在1年以上。