心肌細胞的分離及培養材料和過程

器械：

飯盒、燒杯、彎頭解剖剪（2）、小鑷子（2）、平皿（4）、毛玻片、濾網、離心管（15ml）、移液管、培養瓶、廢液缸、PE手套、橡膠手套、冰盒

溶液：

PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶

動物：

小鼠

準備：

用酒精棉球擦拭臺面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風機吹至實驗結束，提前半小時將培養液、胰酶37℃溫浴。

培養過程：

1、兩個圓皿中加入5ml的PBS培養液，將小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小鑷子開胸取心。

2、取出的心放在一個裝有PBS的平皿中，剔除心臟周邊的血凝及纖維組織。

3、PBS再沖洗后，轉移至另一個預先裝好5ml胰酶的平皿中，用剪子將平皿中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入15ml離心管中，加入3-5ml胰酶沖洗平皿轉移到離心管中。

4、放入水浴鍋中，溫和搖動，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血紅細胞、細胞碎屑和死細胞。

5、再將8-10ml胰酶加入盛有組織的離心管，吸管輕輕吹打1min，消化10min，小心轉移上清+2ml DMEM至另一離心管中，細胞懸液離心，1000轉×10min，棄上清，加培養基為管1。

6、重復第5步，3-8次，直至至組織塊消化為止。

7、將多次細胞懸液經100目濾網過濾，混合。

8、加入1ml DMEM重懸，顯微鏡下觀察并計數。

9、培養1-1.5小時，收集培養液中的非貼壁細胞，小心不要晃動。

10、顯微鏡觀察并計數，細胞密度調至5×105-6×105細胞/ml。

11、4-6小時后，用培養基輕輕沖洗2次，加入培養基繼續孵育過夜。

或從第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培養基終止。