快速便宜的CRISPR／Cas9突變體篩選方法

　　新的基因組編輯工具——如ZFNs、TALENs以及最近的CRISPR/Cas9系統，已經大大提高了在不同動物模型中敲除基因的能力，包括斑馬魚。然而，對數量龐大的動物進行篩選，所需的時間和成本，仍然是一個瓶頸。

　　最近，意大利多恩動物研究所（Stazione zoologica Anton Dohrn）的研究人員，提出了一種快速的、便宜的CRISPR/Cas9斑馬魚突變體篩選方法，有潛力應用于斑馬魚以及適合于基因組編輯的每種動物模型的高通量篩選。相關研究結果發表在12月16日的《Molecular Biotechnology》。

　　在各個研究領域中，基因組操縱越來越正成為反向遺傳學研究的一種常見方法。特別是，隨著新編輯工具（如ZENs、TALENs以及最近的CRISPR/Cas9系統）的引入，已經徹底改變了基因組工程研究。

　　然而，隨著產生變異動物的能力增加，突變體的篩選成為了一個瓶頸。到目前為止，許多不同的技術，如直接測序、熒光定量PCR、T7核酸內切酶I測定、PAGE和HRM，已被描述為檢測目標位點中InDel的有效方法，但同時并不是每個人都能使用它們。

　　當然，最翔實的方法是通過Sanger色譜分析法進行直接測序；然而，這種方法意味著幾個步驟，例如樣品剪碎、基因組DNA提取、靶區域的PCR擴增、克隆和質粒純化，這對于大規模篩選來說成本太高了。

　　出于這個原因，PAGW和T7核酸內切酶I分析，由于成本合適，正在成為最常用的方法，但是它們存在一定的局限性，例如耗時的步驟和假陽性。在可靠性和運行時間方面，一種有效的替代方法，以當前用于大規模InDels檢測的、最有效的HRM技術為代表。事實上，一旦實驗室有適當的設備，HRM程序是很簡單和快速的；然而，并不是所有的實驗室都配備有如此昂貴的設備。因此，目前迫切需要開發一種廉價而有效的策略，可以讓每個人都能用于高通量的突變體篩選。

　　在這項研究中，研究人員提出了一種新的分型方法，具有類似于HRM技術的有效率，但是成本更低，這種方法對用于qPCR的一種常見ViiATM 7 Real-Time PCR系統的一些參數進行了修改。經過幾次試驗，研究人員優化了反應條件，重點是熔煉分析步驟。研究人員對熔煉分析參數進行了優化，以獲得較高可能的檢測分辨率和重復性。

　　緩變率的增加，可使來自分析樣品類型的解離分析結果更加準確，因為分子的解離動力學更快。此外，研究人員優化了工作流程，減少了反應體積（總體積10 ll）。這意味著，每個樣本只用5 ll的Fast SYBR Green Master混合液，從而大大降低了成本。

　　總而言之，這種方法提供了一種簡單、快捷和低成本的InDels檢測程序，可以用于任何研究實驗室。這種方法可以應用于常規qPCR的ViiATM7 Real-Time PCR系統，這樣就避開了昂貴實驗室設備的必要性。與其他篩選方法相比，這種方法表現出更好的優勢和劣勢比，可以被有利地用于常規篩查程序。此外，這種方法有潛力應用于斑馬魚以及適合于基因組編輯的每種動物模型的高通量篩選。