快速檢測乳品中的雙氰胺

本文應用安捷倫QuEChERS前處理方法結合LC-MS/MS對乳品中的雙氰胺實現了快速分析檢測，不同的添加濃度，在0.5ppb~50ppb的線性范圍內在乳粉中的添加回收率范圍均在86%~97%之間，RSD均小于5%，方法具有很好的準確度和重復性。

雙氰胺又名二氰二氨、氰基胍，其應用領域涉及化肥工業，用作氮肥增效劑和長效復合肥料添加劑；醫藥生產用于合成磺胺嘧啶和巴比妥類藥物；還可用于多種染料的合成及加工黏合劑和塑料工業中的固化劑。

2013年1月，享譽全球的新西蘭牛奶及奶制品被檢測出含有低含量的有毒物質雙氰胺，新西蘭政府已經下令禁售含有雙氰胺的奶類產品。新西蘭奶粉雙氰胺的來源是由于新西蘭農民普遍會在牧場使用雙氰胺來防止硝酸鹽等對人體有害的肥料副產品流入河流或湖泊。

美國食品和藥物管理局將雙氰胺添加到安全性待檢測物質名單,雖然國際標準未對食品中的雙氰胺限量，但高劑量的雙氰胺對人體是有毒的，所以建立乳制品中雙氰胺分析檢測方法勢在必行。本方法即是為應對此突發食品安全案件，所建立的乳制品中雙氰胺快速分析解決方案。

實驗內容

儀器與試劑

安捷倫科技有限公司6460 QQQ質譜儀；安捷倫科技有限公司1290 Infinity UHPLC。

乙腈，異丙醇均為色譜純 試驗用水為高純去離子水；雙氰胺標準品（純度）國家標準物質中心；奶粉為市售。

液相色譜柱為Agilent Zorbax-Rx-Sil (3.0×100mm, 1.8 家標，PN. 828975-301)，Bond Elut QuEChERs基質分散固相萃取15 ml凈化管（P/N. 5982-5158 )，美國安捷倫公司。

標準品配制

準確稱取0.010g雙氰胺標準品 用甲醇/水（30/70）定容到10ml的容量瓶中，制成質量濃度為1000μg/ml的儲備液， 從雙氰胺儲備液中取0.1ml用乙腈定容至10ml，制成質量濃度為10μg/ml的雙氰胺標準溶液。

樣品前處理

準確稱取(2 ± 0.02) g奶粉樣品于50ml具塞離心管中, 加入已知濃度的標準品混合均勻，再加入提取液（水：乙腈，V/V=1:4) 20ml，加蓋后震蕩均勻后，渦旋1min，超聲10min，4℃ 10000r/min離心10min，取8ml上清液加入Bond Elut QuEChERs基質分散固相萃取15ml凈化管（P/N.5982-5158）中，渦旋1min，取上清液加入1.5ml離心管中，13000rpm高速離心5min，將上清液轉入2ml樣品瓶中進行LC/MSMS檢測。

儀器方法

高效液相色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax-Rx-Sil (3.0×100mm, 1.8μm，PN. 828975-301)；流動相：流動相A為10 mM的乙酸銨水溶液，流動相B為乙腈。洗脫梯度：0.0~2.0min，98%B；2.0~4.0min，98%B~70%B；4.0~5.0min，70%B~60%B；5.0~5.5min，60%B~40%B； 5.5~9.0min，40%B。流速：0.4ml/min；進樣量：2.0μl；柱溫：35℃；運行時間：9min。

質譜條件：儀器模式：+ESI（JetStream ESI）；干燥氣溫度（Gas Temp）325℃，干燥氣流量（Gas Flow）8ml/min，霧化器壓力（Nebulizer）40psi，鞘流氣溫度（Sheath Gas Temp）350℃，鞘流氣流量（Sheath Gas Flow）11ml/min，毛細管電壓（Capillary）4000V，噴嘴電壓（Nozzle）0V；雙氰胺的定量離子為85→68，定性離子為85→43。MRM參數見表1，安捷倫MassHunter軟件用于定性和定量。

結果與討論

樣品前處理方法的考察

雙氰胺屬于水溶性較強的化合物，所以在提取液中加入一定量水進行提取，同時加入一定比例乙腈，除了可以對乳品中的蛋白起到很好的沉淀作用外，也與后續檢測中高有機相比例進行匹配，更好地消除溶劑效應。試驗中也同時考察了用Agilent Bond Elut PCX 柱進行萃取，發現PCX 柱對雙氰胺基本沒有保留，考慮到乳品中含有脂肪、磷脂、和蛋白類的非極性有機干擾物以及有機酸干擾物等，因此選擇含有Agilent C18和 PSA 填料的Bond Elut QuEChERs 基質分散固相萃取凈化試劑盒，以有效吸附乳品提取液中的基質干擾物，降低離子抑制效應。

儀器方法

本文對雙氰胺采用電噴霧離子源正離子模式測試，實驗結果表明雙氰胺可以生成[M+H]+（m/z 85.1）分子離子峰，選擇[M+H]+ 峰進行子離子掃描，最終確認雙氰胺選擇m/z 68（定量子離子）和43（定性子離子），作為多反應通道監測離子對。

由于雙氰胺極性較強，在反相C18色譜柱上保留較弱，因此采用HILIC 機理對其進行分析，以Agilent Zorbax-Rx-Sil 作為HILIC 色譜柱，以高的有機相為梯度起始比例，進行分析。流動相中添加低濃度乙酸銨促進正離子電離，經過優化后的色譜圖如圖1所示。

儀器方法學考察了靈敏度，線性范圍，穩定性及添加回收率等指標。其中靈敏度測試了0.5ppb 濃度標準品，其信噪比為55.2 ；大于10倍信噪比定量檢出限，結果如圖2所示。

在0.5 ppb~50ppb濃度范圍內，測試線性相關系數大于0.999。各濃度點平行6針測試，峰面積的RSD 均小于6%，具有良好的穩定性，如表2所示。

方法的重復性

分別向空白乳粉中，加入5、10、50μg/kg 添加量的雙氰胺標樣，按照本方法的處理過程制備樣品進行處理和測定，每個添加濃度取3 份樣品，測試回收率。雙氰胺的絕對添加回收率在86~97%之間，RSD 在2.49%~4.48%之間，如表3所示；標準品、空白樣品和添加樣品的譜圖如圖4 所示，可以看出雙氰胺經Agilent Bond Elut QuEChERS 基質分散凈化試劑盒凈化后，基質效應很小，能達到很好的凈化效果和較高的回收率。

小結

應用Agilent BondElut QuEChERS 基質分散凈化試劑盒和1290UHPLC+6460 QQQ高靈敏度液質聯用技術，可以實現對乳品中雙氰胺殘留量的檢測確證分析，同時為乳品中雙氰胺的快速篩查確證分析提供有力的解決方案。采用QuEChERs方法能夠對雙氰胺實現快速、高效的凈化處理，凈化后的樣品基質效應較小，添加回收率可達到86%以上（無同位素內標校正）；采用6460 QQQ分析結果表明在0.5ppb濃度下雙氰胺的信噪比(S/N)=55；在0.5ppb~50ppb濃度范圍內,線性關系和穩定性優異，相關系數R＞0.999，峰面積RSD＜6%。