抗生素抗性基因檢測實驗操作步驟

本文以客戶的案例為背景，介紹了實時熒光定量PCR法檢測抗生素抗性基因的所需的試劑耗材以及詳細的實驗操作步驟。

實驗摘要

以目的DNA為模板，PCR擴增獲得目的片段，進行TA克隆。提取質粒，單酶切線性化，進行梯度稀釋獲得一系列不同濃度的標準品。通過 實時熒光定量PCR ，采用SYBR GREEN染料法，對樣品進行絕對定量。

1.試劑與耗材

試劑與耗材

樣品：45例土壤樣品。膠回收試劑盒，美國Axygen公司，AP-GX-50。

2×Taq PCR MasterMix，南京鐘鼎生物技術有限公司，PC16-1。SoilPure超純土壤基因組DNA快速提取試劑盒，北京艾德萊，DN27。

SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），Bμlk，寶生物工程（大連）有限公司，RR820L。Hind III，寶生物工程（大連）有限公司，1060A。

EcoR I，寶生物工程（大連）有限公司，1040A。pMDTM19-T Vector Cloning Kit，寶生物工程（大連）有限公司，6013。

Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit，北京艾德萊生物有限公司，CV1401。DL2000 DNA Plus Marker（100、250、500、750、1000、1500、2000 bp），南京諾唯贊生物技術有限公司，MD101。

1Kb DNA Ladder Marker（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 kb），南京諾唯贊生物技術有限公司，MD105-01。GelStain，北京全式金生物技術有限公司，GS101-01。

Agarose，西班牙Biowest公司，91622。離心管，美國Axygen公司，311-01-051。

槍頭，美國Axygen公司。其它試劑均為國產分析純。

2.主要實驗儀器

試劑與耗材

熒光定量PCR儀，杭州BIOER，Lightcycle K。基因擴增梯度PCR儀，杭州博日，TC-96/G/H(b)C。

臺式高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司，Allegra 21R。電子天平，美國AHOMS公司，AR5120。

恒溫水浴鍋，美國Amersham Pharmacia公司，MultiTemp III。紫外透射儀，美國Amersham Pharmacia公司，Hofer MV-25。

雪花狀制冰機，日本SANYO公司，SIM-F140AY65。移液器，德國Eppendorf公司。

單人單面（垂直送風）潔凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司，SJ-CJ-1FD。

3.抗性基因檢測實驗步驟及結果

3.1.DNA提取

提取步驟參見SoilPure超純土壤基因組DNA快速提取試劑盒說明書。

3.2.DNA擴增

PCR反應體系如下：

PCR反應體系如下：

3.3.TA克隆

pMDTM19-T Vector Cloning Kit，寶生物工程（大連）有限公司，6013。

Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit，北京艾德萊生物有限公司，CV1401。

（1）將上述PCR產物切膠回收后，在PCR管中配制下列溶液：

（2）室溫（20℃-30℃）連接5 min。

（3）取100 μL感受態細胞，置于室溫解凍，完全解凍后輕彈幾次將細胞均勻懸浮。

（4）加入連接產物，輕輕混勻，室溫放置5min。

（5） 向離心管中加入500 μL不含抗生素的LB培養基，混勻。37℃，200 r/min，30 min。

（6）吸取復蘇后細菌，均勻涂在含Amp的瓊脂培養基上。37℃，倒置待平板吸收全部菌液，過夜培養。

（7）挑取陽性單菌落，PCR檢測，并送樣測序。

3.4.標準曲線的制作

（1）將陽性菌株，接種到含氨芐抗性的LB培養基中，37℃ 200 r/min，搖菌過夜。

（2）提取質粒，通過單酶切后，回收酶切產物。

（3）測濃度，計算拷貝數，制成標準品。

3.5.熒光定量PCR

反應體系的配制（總體積20 μL）：

熒光定量PCR擴增條件的設置：

擴增曲線：94℃ 30 s；94℃ 10 s，60℃ 12 s，72℃ 30 s循環45次，72℃單點檢測信號。

溶解曲線：95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s，連續檢測信號。

3.6.實驗結果