數字PCR和HRM在腫瘤樣本中的應用

摘要：

Vogelstein和Kinzler（美國國家科學院院刊，1999年）第一次描述了Digital PCR（dPCR）的概念，一種在微量細胞群中（如原發性腫瘤組織）鑒定突變的方法。通過稀釋樣品DNA到一個單個分子水平，它可以把PCR自然模擬指數轉化為數字信號。當PCR成功的擴增出這些單個分子,產物可以通過對觀察到的預期的體細胞純合突變峰進行測序分析，而不是典型測序反應中的被遮蓋在背景雜峰中的少量低峰。通過擴增足夠多的單個分子的擴增產物, 基于觀察到的突變體與全部的成功擴增產物的比，微量突變體可以被鑒定出。

方法：

我們采用一種加入HRM使用的改良dPCR方法，通過特殊的HRM曲線圖在原發性腫瘤樣本中發現低含量的突變部分。
數字PCR要求以單個DNA分子作為擴增模板，從而使末端檢測變為數字讀出而不是模擬的DNA混合物。為了應用HRM，需要獲得更多的擴增產物，來得到更加可靠的HRM曲線圖組，因此我們選擇了五不同的稀釋濃度。
這些稀釋樣本是基于后續的靈敏度接近于20%的測序手段去檢測微量突變體. HRM表現出高敏感性,下至2-5%的突變體都可被檢出。因此，一個單一突變基因的復制足以在溶解曲線圖中發現他們的差異.
檢測14種不同癌癥基因，17個樣本表現出存在可能的微量突變體（12）或已知突變（5）。（見表1）

對于已知突變的樣本，建立了含有5％，2.5％和1.25％的微量等位基因的混合物。所有的樣本都進行了目標濃度為5，10，20和40份拷貝的稀釋，擴增循環數24。
在高分辨率熔解曲線分析中排除沒有理想擴增產物的樣品。挑選出顯示可能有突變的稀釋樣品進行測序。圖1 說明了這種dPCR方法中應用HRM的工作流程。

結果：

12個腫瘤樣本中的9個被確定存在微量突變體。而所有的5個已知突變的樣本全部成功的在1.25%稀釋濃度下被鑒定出來。圖2說明了“有效”的濃度可以通過應用表2的概率估計。

在5份拷貝這個稀釋度中存在6個擴增失敗，建議有效地稀釋濃度接近1-1.5倍（3-4.5pg）。

圖3和圖4是一個例子，來演示如何在同一個樣本上運用多重稀釋，以確定理想的稀釋濃度來鑒定微量突變體

圖5a和5b顯示已知的BRAFx15突變分別稀釋在20和40的拷貝數。等位基因分數反映，測序方法與稀釋度很好的對應起來。

結論：

這些結果顯示了與傳統dPCR相比，如何利用HRM預檢改良dPCR方法，顯著的降低后續測序階段的工作來發現微量突變體。
在這項研究中，鑒定候選的HRM曲線比傳統的所有模板重測序的方法減少了90%的工作量。