斯坦福大學借助PacBio首次臨床全基因組測序

　　在Ricky Ramon 7歲時進行一次例行檢查中，猶豫不決的兒科醫生送他去拍一張胸部X光片，結果顯示在他心臟左上腔里有一個良性腫瘤。對于Ramon來說，這是長達二十年的痛苦而漫長的就醫史的開始——伴隨他20年的，是沒完沒了的預約、診斷、和手術。

　　在此期間，非惡性腫瘤不斷重新出現在Ramon的心臟和整個身體中-在垂體腺中，腎上方的腎上腺，甲狀腺結節。。。麻煩的是，醫生無法診斷他的病情。當拉蒙18歲時，醫生認為他的癥狀可能是Carney綜合征—— 一種由PRKAR1A基因突變導致的遺傳病癥。然而，Ramon的DNA測序結果顯示該基因沒有發現會導致疾病的變化。

　　八年后，斯坦福大學醫學院的研究人員使用PacBio長讀測序重新對Ramon的全基因組進行測序，發現了八年前NGS未能檢出的重要缺失，鑒定出Ramon基因組的一段約2,200個堿基對的缺失，并證實Carney綜合征的診斷確實是正確的。這是第一次長片段全基因組測序應用于在臨床，研究人員在6月22日Genetics in Medicine在線發表的這篇論文。

　　拼圖中的漏洞

　　基因組測序簡單來說，就是將基因組DNA切割成碎片，讀取碎片的序列片段，然后使用計算機將序列片段拼接在一起。之所以要那么麻煩切割為碎片，是因為現有的測序技術沒法兒通讀太長的序列，只好把全基因組打成小碎片分別測序。新一代測序技術（NGS）使得短片段的高通量測序變得so easy，但是數據拼接卻成了大難題。這有點像將一本厚厚的巨著撕成碎片，讀取每個碎片上的字/詞組/句子后，再設法拼接回一本書。碎片越小，拼接越困難得多。特別是這大部頭“巨著”里的一些“字”“詞組”或“句子”經常重重復復出現或者丟失，太小的重復碎片定位就幾乎成為不可能。

　　八年前Ramon的基因組測序所使用的新一代測序技術（NGS）屬于短讀序列測序，每次能讀取100個左右的堿基對，兩端雙向測序最長能測到250堿基對左右。這相對于30億堿基對的人類基因組來說，其拼接難度之大，無法定位的漏洞之多，可想而知。如今重新測序Ramon基因組的PacBio長讀測序技術一次可讀取長達數萬堿基的片段，這使得可以將基因組切割為較大的片段，大大降低了拼接難度，更重要的是大大減少了過去無法定位的漏洞，“這將照亮過去從未看到的基因組的黑暗角落。”本研究的資深作者,遺傳學和生物醫學數據科學心血管醫學教授Euan Ashley這樣形容。

　　Ashley認為，雖然短讀序列的成本現在低于1000美元，但是當將DNA切割成太小的片段時，部分真正的基因組序列就無法獲得。例如在整個基因組中，一系列重復的字母，如GGCGGCGGC，可以伸展數百個堿基對。對于只有100個字母的短讀長，幾乎不可能知道這段重復序列到底有多長，但是有時，重復序列的長度可能是決定某人的疾病傾向的關鍵。

　　此外，人類基因組的一些部分是冗余的，這意味著有100個堿基對區段可能適合的很多個位置。這使得在重新組裝基因組時無法知道放置那些片段的確切位置。如果用更長的片段，這種情況發生的幾率就不那么頻繁。

　　鑒于這些問題，在短讀測序中，約有5％的基因組序列不能被一對一地映射。而超過約50個堿基的任何缺失或插入，都可能太長而無法檢測。Ashley說，對于未能診斷病因的病例，短讀序列測序僅能在約三分之一的病例中幫助醫生提供診斷。

　　但是Ramon的情況不是其中。

　　八年前用于分析Ramon基因的NGS技術因為短讀長所限未能識別出一個導致Carney綜合征的基因突變。在此次Ramon基因組的長讀測序研究人員鑒定出一段約2,200個堿基對的缺失，并證實Carney綜合征的診斷確實是正確的。

　　Carney綜合征起因于PRKAR1A基因的突變，其特征在于幾種腫瘤類型的風險增加，特別是在心臟和激素產生腺體如卵巢，睪丸，腎上腺，垂體腺和甲狀腺等。根據美國國立衛生研究院的數據，僅有不到750個有這類癥狀的人得到確診。（可能有許多醫生因為沒聽說過，即使碰到也想不到）

　　這種病最常見的癥狀是良性心臟腫瘤或粘液瘤。心臟手術需要去除心臟粘液瘤。到Ramon18歲的時候，已經進行過三次這樣的手術。他如今正在考慮進行心臟移植手術，對于他的病情進行正確的診斷對于移植小組來說很重要。除了典型的移植篩查之外，Ashley說，移植小組團隊還需要確保患者沒有其他健康問題可能因免疫抑制劑而加重，心臟移植患者必須使用免疫抑制劑來避免排斥捐贈的器官。

　　雖然新發現有助于他的醫療團隊對Carney綜合征進行確認診斷，但Ramon沮喪地發現他不得不面對這個無法逃避的病情。“我很傷心，”他說。“我花了一段時間來接受這樣一個事實，我得一輩子帶著這個病，直到我死亡的那一天。”“壞日子是暫時的風暴，他們會過去的。”“我很高興來到這里。”Ramon最近進行了第四次手術，以消除心臟中的三個腫瘤。Joseph Woo醫學博士是心臟外科手術教授和主席，在斯坦福醫院進行手術。Ashley表示，“這樣年輕的肩膀承受這樣的負擔，并且決定是否要做心臟移植，需要難以置信的勇氣。”

　　臨床的未來

　　由于技術進步和效率的提高，長讀測序的成本一直在急劇下降。Ashley估計本研究使用的測序當前成本在每個基因組$ 5,000至$ 6,000之間。“能用7000-8000bp片段代替100bp，這實在很令人興奮，”Ashley說。他和許多其他醫生都認為，長片段測序技術是基因組學未來的重要部分。“如果我們能夠將長片段測序的成本降到每個人都可以接受的程度，這技術將會非常有用，大放異彩。”

　　Ashley是Stanford Bio-X公司，斯坦福心血管研究所和斯坦福兒童健康研究所的成員。他還是斯坦福繼承性心血管疾病中心的創始董事，斯坦福臨床基因組學聯合主任，以及國立衛生研究院未確診疾病網絡的指導委員會共同主席。