新型冠狀病毒（2019nCoV）核酸實驗室檢測要點

2020庚子之春，突如其來的新冠病毒疫情，又一次將PCR推在疫情防控的前沿，使核酸檢測成為熱搜。那么，什么是核酸檢測？它在新冠肺炎的診斷中起什么作用？如何發揮作用？如何在檢測中保護檢測人員安全、避免交叉傳染和二次污染？為了幫助更多人了解這個熟悉而陌生的名字，帶著諸多問題，讓我們從實驗室角度走近2019-nCoV核酸檢測。

一、新冠病毒核酸檢測的原理? 

　　2019新冠病毒是一種RNA病毒，即遺傳物質是RNA（核糖核酸）。病毒由RNA和蛋白構成，最外一層由脂質和糖蛋白組成包膜外衣，里面蛋白衣殼將RNA包裹在其中，從而使容易降解RNA得到保護。病毒通過特定細胞表面的受體入侵細胞造成感染，并利用宿主細胞進行復制增殖。病毒核酸檢測的原理就是通過細胞裂解液，讓病毒的RNA裸露出來，然后用實時熒光RT-PCR進行檢測。檢測原理最關鍵的是利用引物和探針來實現核酸序列的“靶向匹配”，即尋找新冠病毒約3萬個堿基中區別于其他病毒的核酸序列（與其他病毒核酸相似度“低”的區域），設計引物和探針。因為引物和探針與新冠病毒核酸特定區域高度匹配，即特異性很強，一但待檢標本PCR擴增結果為陽性，則證明該標本中存在新冠病毒。

圖1 新冠病毒結構示意圖

 圖2 新冠病毒核酸測定（實時熒光RT-PCR方法）的步驟

二、核酸檢測對于新冠病毒感染診斷的意義？

　　依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》確診病例要求，臨床診斷病例或疑似病例，具備以下病原學證據之一者：1.呼吸道標本或血液標本實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸為陽性；2.呼吸道標本或血液標本病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。因此，新冠病毒核酸檢測（RT-PCR方法）是確診感染的“金標準”之一，這個“金標準”是指“陽性”結果而言，即擴增陽性可以作為確診新冠肺炎的依據。但另一方面，如果檢測結果為“陰性”，不能作為判斷患者未被感染的標準。根據鐘南山院士發布的近1100例新冠肺炎患者臨床數據顯示，在入院接受CT檢查時，76.4%的患者呈現了肺炎表現，主要為毛玻璃樣陰影（50%）和雙肺斑片狀陰影（46.4%），絕大多數重癥患者都能以此確診。而根據此前專家表態“確診患者中，核酸檢測的陽性率約僅為30-50%”來看，新冠患者核酸檢測假陰性的比例并不低。因此核酸檢測不能作為確診感染的唯一手段，數據顯示如果把CT檢查、核酸試劑盒和臨床癥狀結合在一起，確診的準確率可以達到97%。

三、臨床實驗室進行新冠病毒核酸檢測的條件和要求？

　　核酸檢測實驗室能夠進行2019-nCoV核酸檢測需要符合（國家衛生健康委辦公廳關于醫療機構開展新型冠狀病毒核酸檢測有關要求的通知（國衛辦醫函[2020]53號）的要求，達到二級以上實驗室生物安全防護及三級個人生物安全防護規范并經衛生行政相關部門批準，方可開展。PCR實驗室負壓環境最為理想，注意壓力監測，保持空氣流動，排除氣溶膠。核酸檢測人員必須具備相應資質，接受2019-nCoV相關培訓并考核合格。實驗室應嚴格管理，有效門禁，分區到位，嚴格禁止無關人員進入。清潔區保持通風，消毒到位。相關物品分區放置，潔污分離，按時更換，洗消到位。常規消毒：較大面積以含氯消毒液為主，小面積可以用75%酒精。處理氣溶膠的良好方式是開窗通風，也可以空氣消毒（如紫外、過濾、空氣消毒機方式）。

圖3 核酸檢測實驗室個人三級生物安全防護示意圖

四、新冠病毒核酸檢測與分析流程？

　　核酸檢測三大步驟的具體要求如下：

　　1.分析前----標本采集：在最新版的新冠肺炎診療方案中（第六版），其確診所提到的樣本類型包含了呼吸道樣本、血液樣本、糞便樣本等。在標本選擇上，首選為下呼吸道樣本（如深部痰液、灌洗液等），次選為上呼吸道樣本（如鼻咽拭子等），再次選為血液樣本、糞便樣本等。標本采集由專科（如：呼吸科、發熱門診等）臨床醫生或護士在個人三級生物安全防護條件下進行。標本轉運：標本裝入密封袋，密封袋置于標本盒，注意保持直立不倒，標本盒封閉前消毒。標本盒置于標本轉運箱，轉運箱封閉前，須紫外或噴霧消毒。新冠標本轉運箱要有統一特殊標識。建議醫療機構內部轉運時，標本采集之后立即運抵實驗室，不超過2h。新冠病毒標本要單獨專人轉運，不要和其他物品混雜。如標本外送應用專門的二級標本轉運容器運送，且在個人二級生物安全防護條件下運送。標本接收：從密封袋取出標本后，須紫外或75%酒精噴霧消毒。新冠標本屬于高風險標本，建議采集、轉運、接收環節有簽字，以便回溯。操作者須二級生物安全防護。

　　樣本采集環節中咽拭子取樣有哪些注意細節？新冠核酸檢測最常用的標本為咽拭子，方法為用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。對于新冠病毒，核酸擴增試驗時的處理、抽提、擴增為高風險，因此擴增前需要對標本先行滅活病毒，包括60～65℃孵育20～30min，或者用試劑盒自帶的采樣液滅活病毒。以核酸提取裂解液為基礎配制的病毒采樣液，主要成分為平衡鹽類、EDTA螯合劑、胍鹽(如異硫氰酸胍、鹽酸胍等)、陰離子表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉)、陽離子表面活性劑(如十四烷基三甲基草酸銨)、苯酚、8-羥基喹啉、二硫蘇糖醇(DTT)、蛋白酶K等幾種或多種組分。這種病毒保存液一方面直接裂解病毒釋放核酸，消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。另外一方面，又要讓病毒的蛋白變性，失去活性而“死掉”，不再有傳染性，提高運輸和檢測階段的安全性。

圖4 咽拭子采樣流程圖

　　2.分析中----分析中實驗操作需在實驗室二級生物安全防護條件下進行。標本處理：標本處理整個過程應在生物安全柜內進行，生物安全柜內應配備吸水棉、消毒酒精，有條件時可配備吸水臺布，以防樣本外撒時應急處理，打開樣本密封袋或二級容器，用75%酒精消毒外樣本表面，檢查樣本是否密閉性后，然后取出樣本袋，進行標本滅活處理后，再進行標本離心，標本離心時，開啟通風設施，操作者盡可能在生物安全柜中將離心管放入和取出轉子。標本離心無意外，離心停止10 min以上，開離心機蓋噴霧消毒。標本檢測：新冠病毒核酸檢測需要二名工作人員進行核酸提取或加樣操作。新冠病毒標本核酸擴增試驗時的處理、抽提、擴增均為是高風險過程，個人須三級生物安全防護、全排式生物安全柜內操作。

　　新冠病毒核酸測定（實時熒光RT-PCR方法）的關鍵參數？自國家藥品監督管理局啟動《醫療器械應急審批程序》以來，諸多核酸檢測試劑盒“蜂擁而出”。據不完全統計，國內目前有近百家企業表示已成功研發新冠病毒檢測試劑盒，可供臨床新冠病毒核酸檢測。截至2020年3月6日，國家藥品監督管理局共批準新冠病毒核酸檢測試劑共10個，其中熒光PCR法8個（詳見國家藥品監督管理局官網）。目前批準產品均基于新冠病毒基因組中開放讀碼框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）進行選擇。不同產品的檢測原理基本一致，但是其引物、探針設計存在不同，有單靶區段（ORF1ab）、雙靶區段（ORF1ab、N或E）、三靶區段（ORF1ab、N和E）的檢測和判讀差別，建議使用者應嚴格按照不同企業說明書規定的判讀方式進行判讀。目前，根據《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第四版）》推薦選用針對新型冠狀病毒的ORF1ab和N基因區域的引物和探針，并給出了引物序列。

靶標一（ORF1ab基因）：

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA

熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

靶標二（N基因）：

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

核酸提取和實時熒光RT-PCR反應體系參考相關廠家試劑盒說明。

圖5 新冠病毒擴增子靶標在基因組上的定位

　　3.分析后----報告發放：檢驗報告建議有特殊標識，建議無紙化辦公。發回隔離區的檢驗報告單，除非經過有效消毒，不宜出隔離區。檢測后的消毒處理：檢測完成后，工作人員應立即用75%酒精消毒處理外層手套，脫掉外層手套，放置生物安全柜內的垃圾桶中。檢測完成后生物安全柜用0.5-1%有效氯消毒劑或75%酒精擦拭工作臺面及地面。將安全柜內產生的醫療垃圾裝入三層垃圾袋密封內，放入指定的垃圾桶中，垃圾袋上需標記醫療垃圾信息。生物安全柜和整個實驗室空間均需紫外線消毒，至少30min。工作人員由他人協助用75%酒精對一次性外隔離衣進行消毒處理，脫去隔離衣并放入新冠檢測醫用垃圾指定的垃圾桶中。工作人員在離開二級實驗室后，應在緩沖區脫去脫去二級防護用品，首先戴新手套，摘護目鏡并放入75%酒精中浸泡消毒；脫一次性防護服，自上而下，由內向外，反轉脫一次性防護服，脫一次性手套，摘N95一次性口罩，摘一次性帽子，脫一次性鞋套，脫手套。所有實驗室垃圾均需高壓滅菌處理后，按普通醫用垃圾處理。

五、新冠病毒核酸測定（qRT-PCR法）如何進行結果判讀？

　　依據《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第四版）》提供的引物及擴增參數，基因擴增結果判斷如下。陰性：無Ct值或Ct≥40。陽性：Ct值<37，可報告為陽性。灰度區：Ct值在37-40之間，建議重復實驗，若重做結果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。依據《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第五版）》在實驗室要確認一個病例為新冠病毒核酸檢測陽性，滿足以下兩個條件中的一個：

　　1．同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的檢測結果則需要重新采樣重新檢測。如果仍然為單靶標陽性判定為陽性。

　　2．兩種標本實時熒光RT-PCR同時出現單靶標陽性或同種類型標本兩次采樣檢測中均出現單個靶標陽性的檢測結果可判定為陽性。

　　但是，不同生產企業的產品依據自身產品的性能選定的基因不同，確定的Ct陽性界值也不同，如果用的是商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準。此外，陰性結果也不能排除新冠病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。

六、新冠核酸檢測出現假陰性的原因？

　　目前大家所關注的核酸檢測“假陰性”概念，往往是指核酸檢測結果與臨床表現不符的“假陰性”，即臨床癥狀及影像學高度疑似新冠肺炎，但核酸檢測多次或始終為“陰性”。根據國家衛健委臨床檢驗中心給出的新冠病毒檢測“假陰性”的解釋如下。在被感染者中檢出核酸，需同時滿足以下四個條件，

　　1.被感染者的細胞中有一定量的病毒：現有數據顯示機體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進而到達肺泡，感染者會經歷潛伏期、輕度癥狀、再到嚴重癥狀的過程，不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同。從細胞種類的病毒載量看，肺泡上皮細胞（下呼吸道）＞氣道上皮細胞（上呼吸道）＞成纖維細胞、內皮細胞和巨噬細胞等；從標本類型來看，肺泡灌洗液（最優）＞深咳痰＞鼻咽拭子＞口咽拭子＞血液。此外，糞便也有報道能檢出病毒。但是考慮操作的方便性和患者的接受程度，目前臨床常用的標本順序是口咽部拭子＞鼻咽部拭子＞支氣管灌洗液（操作復雜）和深痰（常為干咳難得到）。因此在某些患者中，口咽部或鼻咽部細胞中病毒量較少或極低，如果只取口咽部或鼻咽部標本檢測，病毒核酸就檢測不到。

　　2.標本采集時要采集到含有病毒的細胞并有效保存病毒核酸：①采集部位不當，如采集口咽拭子時，采集深度不夠；采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，可能采集到的細胞絕大部分都是不含病毒的細胞。②采樣拭子使用錯誤，例如拭子頭的材料推薦使用PE纖維、聚酯纖維、聚丙烯纖維等合成纖維，實際操作中使用了棉花等天然纖維（對蛋白質的吸附較強，不易洗脫）和尼龍類的纖維（吸水性不佳，導至采樣量不足）。③病毒保存管使用錯誤，例如誤用了易吸附核酸（DNA/RNA）的聚丙烯或聚乙烯塑料的保存管，導至保存液中核酸濃度下降。實際操作中推薦使用聚乙烯-丙烯聚合物塑膠與某些特殊處理的聚丙烯塑膠容器儲存病毒核酸。上述環節操作不當均可能造成“假陰性”。

　　3.可靠的體外診斷試劑：部分廠家的試劑產品由于研發時間短，也沒有使用已知臨床樣本進行必要的性能確認，可能存在對試劑優化不充分以及試劑批間差異大等問題。

　　4.規范的臨床實驗室：標本運輸保存條件、臨床實驗室的規范操作、結果判讀和質量控制等也是保證檢測結果準確可靠的關鍵因素。

七、如何才能將新冠核酸檢測“假陰性”的可能降到最低？

　　降低核酸檢測假陰性應相對應地從產生假陰性的四個方面進行優化：

　　1.被感染者的細胞中有一定量的病毒：一個特定的疑似感染的患者，不同的病期，在不同的身體部位出現病毒的濃度會有差異，如咽部沒有，卻可能支氣管灌洗液或糞便中有，如能同時或在疾病過程中的不同時間采取上述多種標本進行檢測，會有助于“假陰性”的避免。

　　2.標本采集時要采集到含有病毒的細胞：通過加強對標本采集人員的培訓，可以在很大程度上解決該問題。

　　3.可靠的體外診斷試劑：通過從國家層面開展試劑的檢測性能評價研究，探討存在的問題，可以進一步改進試劑質量，提高分析敏感性。

　　4.規范的臨床實驗室：通過加強對實驗室人員的培訓，不斷完善實驗室質量管理體系，保證合理的分區、有能力的檢測人員和嚴格的質量管理體系，可以減少因實驗室檢測操作層面出現的“假陰性”。

八、為什么康復出院患者中再次出現新冠病毒核酸檢測“陽性”？

　　新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》中明確規定，在新冠肺炎治愈出院的標準之一就是連續兩次檢測病毒核酸，若兩次檢測結果均為陰性，才具備出院指針，但近來有極少數出院患者中為什么再次出現新冠病毒核酸檢測陽性？會不會再次感染？其原因是多樣的。

　　1.新冠病毒是一個新病毒，它的致病機理、疾病全貌和病程特點還需要進一步加深認識，所以我們一方面要進一步加強對出院患者的管理，要進行14天的醫學觀察，同時觀察當中應加強跟蹤隨訪、健康監測和健康指導，同時對疾病的發生、發展、轉歸的全程進一步加深認識。

　　2.就病毒而言，患者有再次感染的可能。鐘南山院士說：由于治愈的患者體內有抗體，因此新冠病毒再次入侵時可被抗體消滅，再次感染的幾率不大，但“不大”并不代表“不會感染”，再次感染有多方面的原因，可能為康復患者自身的原因，也可能與病毒的改變有關，也可能為實驗室檢測的原因。如果是病毒自身的原因，新冠病毒變異可能導至康復患者自身產生的抗體對變異病毒無效，若患者再次被感染變異病毒，則核酸檢測可能再次陽性。

　　3.就實驗室檢測方法而言，每一種檢測方法都有其極限性。病毒核酸檢測因因基因序列的選擇，試劑的組成，方法的敏感程度等原因，導至現有的試劑盒均存在檢測下限。當患者經過治療后，體內病毒減少，待檢樣本中病毒載量低于檢測下限時即會出現“陰性”結果，但此結果并不意味著體內病毒完全消失，病毒有可能在停止治療后“死灰復燃”。因此，建議出院后2-4周各復查一次，以防漏網之魚。

　　4.就核酸而言，核酸為病毒的遺傳物質，患者經過抗病毒治療病毒被殺滅，但殘骸的病毒遺傳物質RNA（核酸）片段仍然在人體內存留，并沒有完全從體內排出體外，有時在特定的環境下，可以存留較長的時間，而在這時做核酸檢測會出現“一過性”陽性。隨著患者恢復時間進展，在體內殘留的RNA片段逐漸排盡后，核酸可轉為陰性結果。

　　5.就臨床意義而言，新冠病毒的核酸檢測，只是證明病毒RNA的存在與否，不能證明病毒活性以及病毒是否具有傳播性。要證明核酸檢測再次陽性的患者是否會再次成為傳染源，要靠其臨床標本進行病毒培養，培養出“活的”病毒存在才能證明其具有傳染性。

　　綜上所述，新冠病毒核酸檢測與臨床表現不符，如“假陰性”“康復后陽性”的情況無法完全避免，在實際篩查和檢測中，建議應聯合臨床癥狀、影像學檢查（CT）及實驗室檢查（核酸檢查+病毒特異性抗體檢測）進行綜合診斷，以防漏診誤診。如臨床人員對檢測結果感覺明顯不符，建議對整個檢測環節（如樣本的采集、流轉及處理等環節）進行綜合分析，不排除新型冠狀病毒早期感染、復發感染或合并其他呼吸道病毒感染等。如條件允許，建議采集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的樣本進行復測。