李曉江博士：探討用CRISPR／Cas9實現大型動物基因組編輯

　　6月2日，來自中國科學院遺傳與發育生物學研究所的李曉江（Xiao-Jiang Li）研究員在《細胞研究》（Cell Research）雜志上發表了題為“Targeted genome editing in primate embryos”的文章。

　　在這篇文章中他概述了近期在靈長類動物胚胎中應用CRISPR/Cas9的一些研究結果，并著重探討了在構建出非人類靈長類動物人類疾病模型之前CRISPR/Cas9面臨的一些技術問題。

　　在CRISPR/Cas9系統中，特別設計的導向RNA(gRNA)以一種序列特異性方式將核酸酶Cas9引導到基因組DNA處，Cas9在精確的位點切割DNA雙鏈。隨后通過非同源末端連接（NHEJ)或是同源重組(HR)基因組DNA得到修復，由此可導入破壞開放閱讀框的突變，引起基因失活。由于CRISPR/Cas9使得可以在幾乎所有的位點切割基因組，現在這一系統已成為了在各種各樣的物種包括人類胚胎和非人類靈長類動物中遺傳改造基因組的一個強大的工具。

　　開發CRISPR/Cas9用于基因組編輯為我們提供了一種精巧的新方法，無需建立胚胎干細胞來進行基因組操控就可生成大型動物遺傳疾病模型。為了探究CRISPR/Cas9是否可以在非人類靈長類動物的單細胞階段進行基因組DNA編輯，幾個研究小組將CRISPR/Cas9應用于猴的受精卵，發現一些新生猴成功攜帶了靶基因突變。

　　然而，這些研究也揭示出CRISPR/Cas9在非人類靈長類動物胚胎中生成了一些嵌合突變，近期研究人員將CRISPR/Cas9注入到人類三原核受精卵中，他們在衍生出的人類無法存活的胚胎中也看到了這種現象。出于對在人類胚胎中使用CRISPR/Cas9安全性的擔心，以及人類生殖細胞改造相關的一些嚴重倫理問題，探討如何在非人類靈長類動物胚胎中利用CRISPR/Cas9，來忠實地模擬人類疾病具有重要的意義。

　　在這篇文章中，李曉江研究員指出CRISPR/Cas9值得關注的第一個問題就是它的脫靶效應。而第二個問題就是嵌合突變。但CRISPR /Cas9具有一個重要的優勢，就是可以造成雙等位基因突變由此在首建動物（founder animal）中生成無效突變（null mutation）。這一優勢對于構建出大型動物疾病模型尤為重要，因為繁殖大型動物需要較長的事件，使得研究人員無法很快通過交配雜合子突變動物來生成純合子突變。

　　并且，由于CRISPR/Cas9可以破壞雌性動物的雙等位基因，雌性動物應該會因完全喪失靶基因功能而顯示出病狀。為了確保雙等位基因遭到破壞，CRISPR/Cas9可以靶向目的基因的多個位點。就此而言，CRISPR/Cas9為構建出由于一些特定基因喪失功能而引發的人類疾病的非人類靈長類動物或大型動物模型提供了一個強大的工具。

　　此外，CRISPR/Cas9也一直被用于在各種物種中生成敲入突變：然而由于敲入基因要求供體DNA進行精確的同源重組，敲入率比隨機插入/缺失突變率要低得多。而近來這一技術的快速發展已大大提高了CRISPR/Cas9的敲入效率。例如，采用NHEJ抑制劑可以大大提高在哺乳動物細胞中的敲入率。近期，還有研究報道通過直接核傳遞Cas9蛋白質復合物，以及化學合成雙RNA構建出了攜帶功能盒的基因敲入小鼠，效率高達50%。這一新開發的 CRISPR/Cas9系統為其應用于非人類靈長類動物和大型動物中，構建出人類疾病的基因敲入模型或是改造特異的基因提供了廣闊的前景。

　　在文章的最后，李曉江指出考慮到嚙齒類動物和靈長類動物在解剖學、生理學和基因組學上都有相當大的差異，現在需要利用非人類靈長類動物來作為補充模型調查疾病發病機制。利用CRISPR/Cas9來進行基因組編輯使得構建出非人類靈長類動物或大型動物模型，更真實地模擬人類疾病成為可能；雖然目前將其應用于非人類靈長類動物還存在一些技術限制，但這些將有可能很快得到解決，由此將可以構建出更多的非人類靈長類動物和大型動物來證實來自小型動物模型的一些重要發現，或揭示出不存在于小型動物中的一些獨特的病理學和表型。