構建雙重檢查堿基編輯系統提高ABE在大腸桿菌中編輯效率

　　近年來，CRISPR/Cas9的新型堿基編輯技術迅速發展。David Liu實驗室通過將催化失活的Cas9蛋白與胞嘧啶脫氨酶融合在一起，利用具有序列特異性的gRNA引導復合物靶向目標基因，實現了由C到T的單堿基轉換；隨后該實驗室又建立了腺嘌呤堿基編輯器（ABE），實現了由A到G的精確轉換。但是可能由于在大腸桿菌中ABE缺少對未編輯細胞的選擇性壓力導致的編輯效率較低，目前還沒有關于ABE在大腸桿菌中成功編輯的報道。

　　中國科學院天津工業生物技術研究所研究員張學禮帶領的微生物代謝工程團隊和畢昌昊帶領的合成生物技術研究團隊，通過構建兩種不同的ABE堿基編輯系統，實現了ABE在大腸桿菌中的編輯。同時該研究團隊又建立了一種雙重檢查堿基編輯系統（DBE，Double-check base editing），該系統利用活性Cas9可以導致>98%細胞雙鏈斷裂，從而導致細胞死亡的特點，通過在ABE系統的基礎上引入活性Cas9，用阿拉伯糖誘導活性Cas9殺死未發生編輯的細胞，施加對未編輯細胞的選擇性壓力，從而提高ABE在大腸桿菌中的編輯效率。該研究團隊選取大腸桿菌10個不同的gRNA位點對DBE系統進行驗證，堿基編輯的效率均有相應的提高，最高編輯效率可達99%。隨后又在真核細胞H293T中，選取5個不同位點進行相關實驗，結果顯示，由于細胞中的非同源末端連接修復機制較強，細胞基因組N20后堿基序列發生改變，由此得知該DBE系統不適用于真核細胞。該研究實現了大腸桿菌中的ABE編輯，并且構建了DBE系統，顯著提高了ABE在大腸桿菌中的編輯效率，為原核細胞的基因編輯提供了新思路。

　　該研究獲得國家自然基金、科技部“863”計劃和天津市重點專項的支持，相關成果發表在ACS Synthetic Biology。天津工生所與天津科技大學聯合培養碩士研究生信秀青、天津師范大學教授李菊為論文共同第一作者，畢昌昊、張學禮為論文的共同通訊作者。

Double-check堿基編輯系統的機制