氨基酸單向紙層析實驗原理和步驟(1)

一、實驗目的：
1、通過氨基酸的分離，學習并掌握紙層析
的原理和操作技術；
2、掌握分配層析法；
3、掌握影響分配系數的因素。

層析分離技術是利用被分離的混合物中各組分物理化學的性質（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數等）的不同，使各組分以不同程度分布在兩相（流動相和固定相）中，當流動相流過固定相時，各組分以不同的速度移動，從而達到分離。

層析分離技術在20世紀初就已得到應用；
1903年用于植物色素的分離；
1931年用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構體；
1944年出現了以濾紙作為支持物的紙層析。
層析分離的種類很多：
1、按流動相的狀態分類：
（1）液相層析（2）氣相層析；
2、按固定相的使用形式分類：
（1）柱層析（2）紙層析（3）薄層層析等；
3、按分離過程所主要依據的物理化學性質分類：
（1）吸附層析（2）分配層析（3）離子交換層析
（4）凝膠層析（5）親和層析等。

二、實驗原理
紙層析：是以濾紙作為支持物的分配層析法，是20世紀40年代發展起來的一種生化分離技術。由于設備簡單，操作方便，所需樣品量少，分辨力較高等優點而廣泛的用于物質的分離，并可進行定性和定量的分析。缺點是展開時間較長。
分配層析法：是利用物質在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數不同，而達到分離的目的的一種實驗方法。在一定條件下，一種物質在某種溶劑系統中的分配系數是一個常數即α=溶質在固定相的濃度/溶質在流動相的濃度。

溶劑系統：由有機溶劑和水組成，水和濾紙纖維素有較強的親和力，因而其擴散作用降低形成固定相，有機溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細管中自由流動，形成流動相，由于混合液中各種氨基酸的分配系數值不同，其在兩相中的分配數量及移動速率（即遷移率Rf值）就不同，從而達到分離的目的。
移動速率：Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。
影響Rf值的主要因素：
Rf決定于被分離物質在兩相間的分配系數以及兩相間的體積比。由于在同一實驗條件下，兩相體積比是一常數，所以主要決定于分配系數。不同物質分配系數不同，Rf也就不同。
（1）物質的結構和分子極性：
結構不同極性不同，在兩相中的溶解度也就不同，物質的極性決定了物質在水和有機溶劑之間的分配情況，極性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之Rf則較大；
（2）層析溶劑：
首先，溶劑的純度要高，否則需經預先處理（酸堿抽提，重蒸餾，脫水干燥等）；其次，溶劑系統選擇應考慮被分離的物質在溶劑系統中的Rf在0.05～0.85，樣品被分離物質的組分的Rf之差最好大于0.05。再次，有些溶劑系統需必須新鮮配制，如正丁醇-甲酸-水系統久放易引起酯化；最后，溶質和溶劑之間若能形成氫鍵，對分配系數的影響很大；
（3）pH 值：
溶劑、濾紙和樣品的pH值都會影響物質的解離，從而影響物質的極性和溶解度，使Rf改變；溶劑的pH還可以影響流動相的含水量，溶劑的酸堿度大，吸水量多，使極性物質的Rf增加（將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理）；