氨基酸的紙層析(paperchrmatography)

一、 實驗目的
1.了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。
2.學習紙層析法的操作技術，分析未知樣品氨基酸的成分。
二、 實驗原理
用濾紙為支持物進行層析的方法，稱為紙層析法，它是分配層析法的一種。紙層析所用的展層溶劑大多是由水飽和的有機溶劑組成。濾紙纖維的—OH 基的親水性基團，可吸附有機溶劑中的水作為固定相，有機溶劑作為流動相，它沿濾紙自下向上移動，稱為上行層析；反之，使有機溶劑自上而下移動，稱為下行層析。將樣品點在濾紙上進行展層，樣品中的各種氨基酸即在二相中不斷進行分配，由于它們各自的分配系數不同，故在流動相中移動速率不等，從而使不同的氨基酸得到分離和提純。紙層析法主要是依據混合組分對二相分配系數的差異進行分離，但亦存在著某種程度的吸附作用和離子交換現象。氨基酸經層析在濾紙上形成距原點不等的層析點，氨基酸在濾紙上的移動速率用Rf 表示。
Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離
只要實驗條件(如溫度、展層溶劑的組分、pH、濾紙的質量等)不變，Rf 值是常數，因此可做定性分析參考。如果溶質中氨基酸組分較多或其中某些組分的Rf 值相同或近似，用單向層析不宜將它們分開，為此可進行雙向層析，在第一溶劑展開后將濾紙轉動90度，以第一次展層所得的層析點為原點，再用另一種溶劑展層，即可達到分離目的。由于氨基酸無色，可利用茚三酮反應使氨基酸層析點顯色，從而定性和定量。
三、儀器和試劑
儀器
層析濾紙、燒杯、剪刀、層析缸、培養皿、猴頭噴霧器、微量加樣器或毛細管、吹風機一個、直
尺、鉛筆等。
試劑
1.混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉)
甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶于5mL 水中。
蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于5mL 水中。
亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于5mL 水中。
氨基酸混合液： 甘氨酸50mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg 共溶于5mL 水中。
2. 展層溶劑
堿相溶劑：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇 = 13∶13∶13(V/V)
酸相溶劑：正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(V/V)，搖勻后放置半天以上，取上清液備用。
3.顯色貯備液： 0.4mol/L 茚三酮—異丙醇∶甲酸∶水=20∶1∶5。
4.0.1% 硫酸銅：75%乙醇=2∶38，臨用前按比例混合。
四、實驗步驟
(1)標準氨基酸單向上行層析法
1.畫基線
戴上指套或橡皮手套，在長約20cm、寬約17cm 濾紙上，距短邊2.5cm 處，用鉛筆畫一條線，即為基線。
2. 點樣
在原線上，從距紙的長邊4cm處開始，每隔3cm 用微量注射器或毛細管依次分別點上甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和混合氨基酸溶液。點樣點干后可重復點加1～2次。每一點的直徑不超過2mm，點樣量以每種氨基酸含5～20ug 為宜。
3.展層
將點好樣的濾紙卷成筒形，濾紙兩邊不相接觸，用線固定好，將原線的下端浸入盛有溶劑的培養皿中，不需平衡可立即展層。展層劑為酸性溶劑系統，在展層溶劑中加入顯色貯備液(每10mL 展層劑加0.1～0.5mL 的顯色貯備液)進行展層，基線必須保持在液面之上，以免氨基酸與溶劑直接接觸。蓋好層析缸，當溶劑前沿距紙端2cm 時(大約3h)，取出濾紙。
4. 顯色
濾紙取出后，吹干或在80℃左右烘箱內烘3～5min，即出現紫紅色的氨基酸層析斑點。用鉛筆劃下層析斑點，可進行定性、定量測定。
(2) 混合氨基酸雙向上行紙層析法
1.濾紙準備
將濾紙裁成約28cm2的正方形，在距濾紙相鄰兩邊各2cm 處的交點上，用鉛筆劃下一點，做為原點。
2.點樣
取混合氨基酸溶液(5mg/mL)10～15μL，分別點在原點上。
3.展層與顯色
將點好樣的濾紙卷成半筒形，立在培養皿中，原點應在下端。取少量12%的氨水與小燒杯中，蓋好層析缸，平衡過夜。次日，取出氨水，加適量堿相溶劑(第一向)與培養皿中，蓋好層析缸，上行展層，當溶劑前沿距濾紙上端1～2cm 時，取出濾紙，冷風吹干。將濾紙轉90o，再卷成半筒形，豎立在干凈培養皿中，并于小燒杯中至少量酸相溶劑，蓋好層析缸，平衡過夜，次日將加顯色劑的酸性溶劑(每10mL 展層劑加0.1～0.5mL 的顯色貯備液)傾入培養皿中，進行第2向展層。展層畢，取出濾紙，用熱風吹干，藍紫色斑點即顯現。
五、計算
單向層析的Rf 值，按 “Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離”計量后計算。雙向層析Rf 值，由兩個數值組成，在第一向計量一次，第二向計量一次，分別與已知的氨基酸在酸堿系統的Rf 值對比，即可初步決定它為何種氨基酸的斑點，將它剪下，在同一張紙剪下一塊大小相同的空白紙作為對照，用硫酸銅—乙醇溶液洗脫，用722型分光光度計測定其吸光度，在標準曲線上查出氨基酸的含量。