測序污染有多危險，如何防范與去除[實驗手冊]

　　一些研究表明，目前已經公布的基因組存在多種污染，隨著這個問題越來越突出，我們需要找出方法來應對

　　生物通報道：Supratim Mukherjee在進行數據分析的時候，發現數以百計的微生物基因組中會重復出現同一種噬菌體序列，這令他感到很驚訝。這位來自勞倫斯伯克利國家實驗室的生物信息學家最開始是為了比對這些微生物的代謝途徑，但后來他發現了幾乎無處不在的序列，“我以為我們發現了一些新的東西，”他回憶道，“在這些不同的微生物中，這整個噬菌體基因組是完整地保留下來的。”

　　但當Mukherjee一開始分析這個噬菌體序列時，他就知道這就是 PhiX 序列，一種Illumina公司測序試劑盒中用做標準品的噬菌體。PhiX 本來是作為一種質控檢測指標，用于追蹤每個測序過程中出現的錯誤率的，但在上百個案例中，Mukherjee發現研究人員都沒有從其公布的基因組序列中剔除Phi X的序列。

　　并不是只有Mukherjee一人發現此種情況，最近大量的報告表明，發表的基因組出現污染要不之前想象的多得多。那么這些污染是如何出現的呢？我們有能做些什么，避免這些情況的出現呢？

　　就此The Scientist雜志請教了幾位研究人員，他們分享了他們的一些Tips，可以檢測和預防出現“流氓序列”。

　　廣泛的基因污染

　　在Mukherjee 研究組意識到 PhiX 污染可能會出現了多個公布的微生物基因組中之后，這一研究組覺得量化其出現頻率。通過分析調查，Mukherjee等人發現在已出版的1.8萬個細菌和古細菌基因組（Integrated Microbial Genomes database）中，超過1000個序列被PhiX 序列污染。今年Mukherjee等人已經將這一發現公布在Standards in Genomic Sciences上。而這些其中的10%也出現在了同行評審的期刊雜志中。

　　PhiX 污染還只是冰山一角――現在問題呈指數級增長，NCBI總監David Lipman說，他也正在篩選過去五年間，呈遞到GenBank中的數據。

　　“我們檢測到2012年細菌和古細菌的污染情況還只有2%-3%，” Lipman說，“但之后就急速攀升，到2014年，已經接近了10%。今年到目前為止，這一比率達到23%”。

　　Sanger研究所的科學家們也發現，DNA提取試劑盒、化學試劑和實驗室環境中的雜菌很容易造成污染，影響微生物組分析的結果。

　　研究人員發現，沒有污染的話對照樣本應該只有一種菌，但有時卻出現了270種不同的細菌。與高生物量的樣本相比（糞便樣本），來自血液或肺部的低生物量樣本尤其容易受到污染。

　　“現在的DNA測序技術允許人們進行深度測序，被廣泛用于稀少微生物群體的分析。我們發現，這類樣本很容易被其他來源的DNA污染，要么在收集樣品的時候，要么在DNA提取和擴增過程中。污染會對研究結果產生很大的影響，這一點需要研究者們給予足夠的重視，”Sanger研究所的Alan Walker博士說。

　　而且微生物也不是唯一出現這么多污染的研究領域，去年倫敦大學學院的計算機專家William Langdon發現，千人基因組計劃中至少7%受到了支原體遺傳物質的污染（BioData Mining, 7:3, 2014），因此如果說你對污染的基因組感到頭疼的話，放心，你不是唯一一個。

　　污染從哪里來？

　　來自圣地亞哥州立大學的生物信息學家Rob Edwards說，污染出現的來源很多，“首先就是實驗室成員可能混淆了兩個樣品，不小心給文件或者樣本貼上了錯誤的標簽。這些都可以通過加強實驗室管理，提高實驗記錄保存制度等很容易解決。”

　　另一方面，污染也有可能來自其它本不應該出現在樣品中的外來遺傳物質，又或者來自培養細菌周圍的環境，Edwards說。即使你認為自己測序的是單一培養產物，但是在一個測序循環中出現多個物種的情況，并不少見。

　　此外，如果正在測序來自人類腸道的微生物，那么樣品中自然會出現人體細胞，還有即使你只想要測序某個生物體的細胞核基因，也會出現細胞內線粒體和葉綠體基因，這些也都是污染。這些污染當然很難完全避免，但是可以采取一些措施：在測序之前清理樣品，或者在測序結果中剔除污染的序列。

　　Edwards的研究組聚焦于來自環境樣品的宏基因組測序，他表示其研究組就常常利用過濾設備，根據大小對病毒和細菌混合物進行分離。如果他們推測樣品中存在人體DNA的污染，那么就會先剔除這些序列，只留下微生物的基因樣本。