| 實驗步驟 | 第1階段：RNA和DNA的分離
一次雙向消減，需要總量為2ug的基因組DNA或cDNA。大多數分離RNA和基因組DNA的方法都適用于本實驗（Sambrooketal.1989；Chomczynskiand Sacchi 1987；Farrell1993)。如果可能，盡可能使用同樣的試劑和方案純化待比較的樣品。如果是基因組DNA作為初始材料，下一步為RsaⅠ 消化（本方案的第3階段）；如果是RNA作為初始材料，下一步則為cDNA的合成（本方案的第2階段）。
第2階段：cDNA的合成
一、材料
1.緩沖液、溶液和試劑
dNTP溶液（10mmol/L)
DTT,0.1mol/L
EDTA,0.2mol/L
第一鏈緩沖液，5X
礦物油
SSH技術需要很精確的PCR。根據作者的經驗，礦物油是維持精確性所必需的.只有在缺乏礦物油而且樣品更容易分析時，才使用熱蓋做大規模的PCR篩選.因此筆者強烈建議，在方案5之前不要使用熱蓋。
第二鏈緩沖液，5X
TN緩沖液（10mmol/LTris-HCl，pH7.6，10mmol/LNaCl)
2.酶和酶緩沖液
AMV逆轉錄酶（20U/ul)
3.核酸和寡核苷酸
cDNA合成引物（10umol/L)
poly(A)+RNA
4.放射性化合物
可選：[a-32P]dCTP(10mCi/ml，3000Ci/mmol)(lCi=3.7X1010Bq)
5.專用設備
熱循環儀，或者預設為16°C、42°C和72°C的水浴
6.附加試劑
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的試劑
二、方法
1.第一鏈cDNA的合成
（1）在0.5ml離心管中，將每個檢測和驅動樣品與下面的成分混合。
poly(A)+RNA(2ug ） 2~4ul
cDNA合成引物（10umol/L) 1ul
H20 加至5ul
（2）用一滴礦物油覆蓋樣品表面，在72°C熱循環儀或水浴中溫育2min。
（3）在室溫下冷卻2min。
（4）在每個反應管中加入下列成分。
第一鏈緩沖液，5X 2ul
dNTP溶液（各10mmol/L) 1ul
H2O* 0.5ul
DTT,0.1mol/L 0.5ul
AMV逆轉錄酶（20U/u1) 1ul
*可選：要想檢測cDNA合成的進程，將0.5ul[a-32P] dCTP(10mCi/ml,3000Ci/mmol)加入到9ul H20中，再取0.5ul稀釋的標記物代替上面的H20
（5）輕柔地渦旋混勻，并短暫離心。
（6）在熱循環儀或水浴中，將離心管42°C溫育90min。
（7）將離心管置于冰上，中止第一鏈cDNA的合成，并立即進入第二鏈cDNA的合成。
2.第二鏈cDNA的合成
（8）將下列成分（在冰上預冷）加到第一鏈合成管中。
滅菌H2O 48.4ul
第二鏈緩沖液，5X 16.0ul
dNTP溶液（10mmol/L) 1.6ul
第二鏈合成酶混合物，20X 4.0ul
（9）混勻并短暫離心，最終體積應該為80ul。
（10）將離心管在16°C(水浴或熱循環儀）溫育2h。
（11）加入2ul(6U)T4DNA聚合酶，充分混勻。
（12）在水浴或熱循環儀中，將離心管16°C再溫育30min。
（13）加入4ul 0.2mol/LEDTA,中止第二鏈的合成。
（14）進行酚：氯仿抽提和乙醇沉淀。
（15）用50ul TN緩沖液重新溶解沉淀。
（16）從上面溶液中取6ul，加到一個新的離心管中，-20°C保存到Rsa I消化之后。
這個樣品將進行瓊脂糖凝膠電泳，以估計dscDNA合成產物的產量及大小范圍。
第 3 階段：RsaⅠ消化
進行以下操作程序，處理每個實驗所用的雙鏈驅動和檢測 DNA 樣品。這一步產生最適于消減雜交的短的、平末端 dsDNA 片段。
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
EDTA,0.2mol/L
TN 緩沖液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6,10 mmol/LNaCl)
2. 酶和酶緩沖液
RsaⅠ(10U/ul)
限制緩沖液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
由第 1 階段獲得的基因組 DNA, 或者由第 2 階段獲得的 cDNA, 每個雙向消減反應需 2ug
4. 專用設備
水浴，預設為 37°C
5. 附加試劑
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的試劑
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備
二、方法
1. 將下列試劑加入上面第 2 階段 [原文為方案 2(Protocol2)——編者改] 第 8 步的離心管或基因組 DNA(gDNA) 樣品中。
ds cDNA 或基因組 DNA 43.5ul
尺似 1 限制緩沖液，10X 5.0ul
RsaⅠ(10U/ul) 1.5ul
2. 混勻，在 37°C 下溫育 2~4 h。
3. 檢測 RsaⅠ消化的效率，通過 2% 的瓊脂糖凝膠電泳分析 5ul 消化產物，用未消化的DNA[第 1 階段（原文為方案 1--編者改）的基因組 DNA] 作對照。在電泳過程中繼續消化，直到對分析結果滿意時再中止反應。
4. 加入 2.5ul0.2mol/LEDTA, 中止消化反應。用酚：氯仿抽提，并用乙醇沉淀法收集 DNA。
本步驟不推薦使用糖原或任何類型的共沉淀劑。這些試劑可能提高 DNA 溶液的黏度，并抑制后面的DNA 雜交。同時也應避免使用基于硅介質的 PCR 純化系統。
5. 每個沉淀用 6ulTN 緩沖液（不用 H20) 溶解，-20°C 保存。驅動 DNA 的制備至此就完成了。
第 4 階段：接頭連接
強烈推薦每一對檢測/驅動 DNA 都在兩個方向進行消減。設計正向消減是為了富集檢測者中存在而驅動者中不存在的差異分子，設計反向消減是為了富集驅動者中存在而檢測者中不存在的差異分子。利用正向和反向消減 DNA，對于最終的消減檢測者 DNA 文庫的差異篩選（方案 6) 是很有用的。檢測 DNA 分別與 Adi(檢測者 1-1 與 2-1) 和 Ad2R(檢測者 1-2 與 2-2) 連接。還應該做一個兩個接頭（Adi 與 Ad2R) 同檢測 DNA(未消減的檢測者對照 1-c 和 2-c) 的連接，作為消減反應的負對照。接頭不連接驅動 DNA。
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
ATP,3 mmol/L
EDTA,0.2mol/L
礦物油
TN 緩沖液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6,10 mmol/LNaCl)
2. 酶和酶緩沖液
連接酶緩沖液，10X
T4 DNA 連接酶（400U/ul)
3. 核酸和寡核苷酸
接頭 Ad1(10umol/L)
接頭 Ad2R(10umol/L)
RsaⅠ消化的檢測 DNA
4. 專用設備
水浴，預設 37°C
5. 附加試劑
酚：氯仿抽提和乙酵沉淀所需的試劑
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備
二、方法
1. 從上面 RsaⅠ消化過的檢測 DNA 中取出 1ul，用 5ul TN 緩沖液稀釋。
2. 按照下列成分，為每個反應配制主體連接混合液。
H2O 2ul
連接緩沖液，5X 2ul
ATP(3 mmol/L) 1ul
T4 DNA 連接酶（400U/ul) 1ul
3. 對每一個檢測 DNA 混合液，按照所示的順序，與以下試劑一起加到 0.5 ml 離心管中。吸打溶液，使之徹底混合。
4. 在一個新離心管中，將 2^1 的檢測者 1-1 與 24 的檢測者 1-2 混合。這是作為非消減的檢測者對照 1-c。對于每個檢測 DNA 樣品，都同樣做一個對照。連接之后，在每一個未消減的檢測者對照管中，大約有 1/3 的 DNA 分子會被接上兩個不同的接頭，從而適于使用帶有接頭的引物進行指數式的 PCR 擴增。
5. 用一滴礦物油覆蓋樣品，短暫離心后在 16°C 溫育過夜。
6. 加入1ul 0.2mol/LEDTA, 中止連接反應。
7.72°C 處理樣品 5 min, 使連接酶失活。
8. 從每個未消減檢測者對照（1-c，2-c…）中取出1ul，用 1ml TN 緩沖液稀釋。這樣品將用來做 PCR 擴增（方案 3)。
實驗中連接接頭的檢測 DNA1-1 和 1-2 至此就制備好了。
9. 進入下一部分操作前，先進行連接效率的檢測。
第 5 階段：連接效率檢測
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
dNTP 溶液（包含所有 4 種 dNTP，每種為 10 mmol/L)
礦物油
2. 酶和酶緩沖液
PCR 緩沖液，10X(40 mmol/L Tricine-KOH，22°C 下 pH9.2;3.5 mmol/L 乙酸鎂;10 mmol/L 乙酸鉀；75 mg/mlBSA，或者廠商提供）
聚合酶混合液，50X (Advantage2，Clontech，或相當產品）
3. 核酸和寡核苷酸
PCR 引物 P1
未消減對照樣品（方案 1 第 4 階段第 4 步）
4. 專用設備
熱循環儀
5. 附加試劑
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備
二、方法
1.從每個未消減對照樣品中各取 1ul, 分裝到 0.5 mlPCR 管中。
2.將以下試劑混合，為所有反應配制主體琨合液。
H2O 19.5ul
PCR 緩沖液，10X 2.5ul
dNTP 溶液（每管 10 mmol/L) 0.5ul
PCR 引物 P1 1.0ul
聚合酶混合液，50X 0.5ul
總體積 24.0ul
3.混勻并短暫離心。
4.第 1 步準備的每個反應管中，各分裝 24ul 主體混合液
5.用 1 滴礦物油覆蓋樣品。
6.將反應混合液放在熱循環儀中，72°C 溫育 5 min, 以延伸接頭。
7.立即進行以下熱循環。
8.每管取 4ul, 在 2% 瓊脂糖凝膠上進行分析。
重點：這個 PCR 產物應該具有 RsaⅠ消化 DNA 類似的模式。如果 15 個循環后，沒有可見的 PCR 產物，要另加 3 個循環，再分析 PCR 產物。如果 21 個循環后還沒有可見的 PCR 產物，則需要檢査聚合酶混合液的活性。如果聚合酶混合液或其他 PCR 試劑的活性沒有問題，應該用新鮮的樣品重復連接反應，再進入下一步。 展開 |
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