液相色譜（HPLC）入門（一）

什么是液相色譜?

歷史概述和定義

液相色譜的定義是二十世紀早期由俄羅斯植物學家 Mikhail S. 茨維特提出的。他最先嘗試在裝滿顆粒的柱子上使用溶劑來分離從植物中提取的化合物[樹葉色素]。茨維特用顆粒填滿開口的玻璃柱。他發現兩種特殊的材料，粉筆末(碳酸鈣)和氧化鋁很有用。他將樣品[混勻植物葉的溶劑提取物]倒入柱中，并讓樣品流過顆、粒床。隨后加入純溶劑。隨著樣品由于重力自上而下流過柱子，可看到不同顏色的譜帶被分開，因為有些組分比另外一些移動得快。他將這些分開的不同顏色的譜帶與樣品中原有的不同化合物相關聯。他還根據每一種化合物對填料的化學親和性強弱，提出了分析這些化合物的分離規律。與顆粒填料有較強親和性的化合物移動慢，與溶劑有較強親和性的化合物移動快。這個過程可這樣描述：樣品中的化合物在流動的溶劑(流動相)與固體顆粒(固定相)間的分布不一樣。這樣使每一種化合物以不同的速度移動，從而產生了化合物之間的分離。

茨維特使用色譜法 chromatography [來自希臘字， chroma 意思是顏色， graphy 意思是記錄 - 直譯為顏色記錄] 來描述他的彩色試驗。[令人好奇的是，俄羅斯名字茨維特意思是顏色。]今天，液相色譜法，以各種形式，已成為分析化學中最有力的工具之一。

技術1. 樣品被點在固定在玻璃板上的薄層色譜顆粒[固定相]上，并流過薄層[圖 B]。玻璃板的底端放置在溶劑中。由毛細作用產生的流動使溶劑[流動相]擴散到干燥的顆粒層并沿玻璃板向上移動。這種技術被稱為薄層色譜法或 TLC。

技術 2. 在圖 C 中, 樣品被點在紙上[固定相]。溶劑[流動相] 加在樣品點的中心以產生向周圍的輻射流動。這是紙層析的一種方式。[傳統的紙層析色譜和直線流動的薄層色譜是類似的操作方式。]上圖中，相同的黑色 FD 和 C 染料被點在紙上。

圖 C: 紙層析法

當和薄層色譜板比較的時候，請注意這種特殊紙張分離能力的區別。綠色圓環表示這張紙無法分離黃色和藍色染料，但它可以將紅色染料分離開來。下圖中，由同樣的黃色和藍色染料組成的一個綠色樣品點在紙上。如你能預料的，這張紙無法分離這兩個染料。在圖中，由紅色和藍色組成的紫色樣品被點在紙上，它們被分離得很好。

技術3.在這個最有效的方法中，樣品流進一個柱子或填有適當顆粒[固定相]的柱管裝置。這些顆粒稱為色譜填料。溶劑[流動相]流過這個裝置。在固相萃取中[SPE]，樣品被裝入柱管里，溶劑攜帶樣品流出這個裝置。正如在茨維特的試驗中，樣品中化合物由于在管路中的流動速度不同而得以分開。黑色樣品被放入柱管里。每一步使用不同溶劑得到分離。

圖 D-1: 柱色譜法 - 固相萃取 [SPE]

當使用管路的形式時，有幾種方法可以產生流動。重力或真空可用在不能承受壓力的柱子上。特別是，本試驗中使用的顆粒粒徑較大[大于五十微米]，所以產生的流動阻力很小。開口玻璃柱[茨維特的實驗]是個典型的例子。除此之外，小型塑料柱，典型的例子是針筒的形狀，可裝入填充物顆粒用于分離樣品。這種方法稱為固相萃取[SPE]。在此，管狀的色譜裝置稱為固相萃取小柱，通常在真空助力下流動，被用來凈化復雜樣品以便進一步分析。要想提高分離能力，必須使用粒徑小的填料顆粒[小于十微米]。然而，小顆粒對流動產生更大的阻力，所以要獲得預期的溶劑流速，需要更高壓力。必須設計能承受更高壓力的泵和柱子。利用中高壓力使溶劑流過色譜柱的方法，就稱為 HPLC。

圖 D-2: HPLC柱

什么是高效液相色譜法[HPLC]?

縮寫 HPLC, 引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大會上的文章，原指在填料柱中產生所需的流速需要高壓 (high-pressure) 這個事實。早期的泵只能承受 500 psi [35bar]。這就被稱為高壓液相色譜法[HPLC]七十年代早期取得極大進步。新型的高壓液相色譜儀器可以承受 6,000 psi [400 bar]的壓力，還能配上改進的進樣器，檢測器和色譜柱。高壓液相色譜法確實開始成為二十世紀七十年代中晚期的普遍分析方法。隨著這一期間不斷的性能改進[更小顆粒，更高壓力], 字母縮寫保持一樣，但全稱變為高效 (high-performance) 液相色譜[HPLC]。高效液相色譜[HPLC]是目前分析化學最強大的工具之一。它能夠分離、定性和定量任何可以溶解在液體中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千萬分之一[ppt]也可。

高效液相色譜如何工作?

一個儲液瓶裝有溶劑[稱為流動相，因為溶劑是流動的]。一個高壓泵[溶劑傳輸系統或稱溶劑管理器]用來產生和計量流動相的流速，一般是毫升/分鐘。一個進樣器[樣品管理器或自動進樣器]可以將樣品導入[注射]連續的流動相 ，并由流動相攜帶樣品進入高效液相色譜柱。色譜柱裝有能獲得分離效果的填料。這種填料稱為固定相因為它被柱硬件包圍住。檢測器用來查看化合物流出色譜柱時被分開的譜帶[大多數化合物沒有顏色，所以人眼觀察不到]。流動相流出檢測器可被送至廢液瓶，或按需被收集。當流動相含有一個分開的化合物譜帶，高效液相色譜可以收集含有純化的化合物的該洗脫組分，用于進一步分析。這種方法稱為制備液相[在高效液相色譜量級中討論]。注意高壓管路和附件用來連接泵、進樣器、色譜柱和檢測器單元，形成流動相、樣品和化合物分離譜帶的通路。

圖 E 描述了高效液相色譜系統的各組成部分。

檢測器連接計算機數據站，高效液相色譜系統單元先記錄電信號，再將電信號轉換為色譜圖，在顯示屏上展現出來。定性和定量樣品內溶物濃度(如圖F)。由于樣品中化合物性質差異很大，幾種類型的檢測器被開發出來。例如，如果一個化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收檢測器。如果這個化合物發熒光，可使用熒光檢測器。如果該化合物沒有上述性質之一，可使用更廣泛的檢測器，如蒸發光散射檢測器[ELSD]。最強大的方式是順序使用多個檢測器。例如，紫外和/或蒸發光檢測器可和質譜儀[MS]聯用來分析色譜分離的組分。這樣，從一次進樣，可得到分析物的更多綜合的信息。將質譜與高效液相色譜系統耦合稱之為液質用.

高效液相色譜操作

一個簡單的方法來理解如何獲得樣品中化合物的分離，如圖 G 中簡圖所示。流動相從左側進入色譜柱，流過顆粒層，再從右側流出。綠色箭頭代表流動方向。首先，上圖表示在零時的色譜柱[進樣時]，當樣品進入色譜柱并開始形成一個譜帶。這里顯示的樣品，是黃色、紅色和藍色染料的混合物，在進樣口形成一條單一的黑色樣品帶。

[現實中，這個樣品可以是任何能夠溶解在溶劑中的物質；一般來說化合物是沒有顏色的，色譜柱壁也不透明，所以我們需要一個檢測器來查看洗脫出來的分離組分。]

幾分鐘后 [下圖], 流動相連續并穩定通過填料層，我們可以看到不同的染料已經以不同的速度在分離開的譜帶中移動。這是因為在流動相和固定相之間存在對每種染料或分析物的吸附競爭。留意黃色染料譜帶移動最快，即將流出色譜柱。黃色染料比其他染料更喜歡[被吸附于]流動相。因此，它的流動速度較快，更為接近流動相的速度。藍色染料譜帶喜歡填料而不是流動相。它與填料顆粒有較強的吸附力使得它移動明顯更慢。換句話說，它是這個混合樣品中最強被保留的化合物。紅色染料譜帶對流動相吸引力一般，因此在色譜柱中的移動速度中等。由于每一種染料譜帶移動速度不同，我們能夠進行色譜分離。

Figure G: Understanding How a Chromatographic Column Works - Bands

什么是檢測器?

當分開的染料譜帶離開色譜柱后，它們馬上進入檢測器。檢測器帶有可以在流動相背景下看[檢測]到每個分開的化合物譜帶的流通池[如圖 H]。 [實際上，在通常的高效液相色譜分析濃度下許多化合物的溶液都是無色的。]一個合適的檢測器有能力辨別化合物的存在，并發送相應的信號到計算機數據站。正如前面談到的，根據所需分離和分析的化合物的特性和濃度，可以在眾多的檢測器中選擇其一。