煮沸裂解法制備質粒DNA實驗——煮沸裂解法大量制備質粒DNA

抗生素乙醇異丙醇乙酸鈉STETTE溶菌酶

LB、YT 或 Terrific 培養液沸水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

(1) 用于篩選質粒的抗生素

(2) 氯霉素（34 mg/ml）

(3) 乙醇

(4) 異丙醇

(5) STE

(6) STET

(7) TE ( pH 8.0 )

2. 酶和緩沖液

(1) 溶菌酶（10 mg/ml )

(2) 限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠

4. 培養基

LB、YT 或 Terrific 培養液

5. 離心機和轉頭

Beckman SW41 Ti 轉頭或與之相當轉頭；Sorvall GSA 轉頭或與之相當轉頭；Sorvall SS-34 轉頭或與之相當轉頭。

6. 特殊設備

沸水浴、本生燈、紗布（4層）。

二、方法

1. 細胞的制備

(1) 挑取轉化細菌的單菌落或 0.1~1.0 ml 單菌落的培養物，接種到 30 ml 含適當抗生素的培養液（LB、YT 或 Terrific 培養液）中。

為了確保培養物通氣良好：試管的體積應該至少比細菌培養物的體積大 4 倍；試管不宜蓋緊；培養過程中要在 250 r/min 下劇烈振搖。

(2) 在適當的溫度及搖速（250 r/min ) 下培養菌液直至對數生長期晚期（OD₆₀₀約為 0.6 )。

(3) 在 2 L 的燒瓶中，將 25 ml 對數生長期晚期的菌液接種到含適當抗生素的 500 ml 的培養基（LB、YT 或 Terrific 培養液（預熱到 37 ℃））中。將此培養基在 37℃ 劇烈振搖（250 r/min ) 條件下培養約 2.5 h。

最后菌液的 OD 值應約為 0.4。不同菌株之間或同一菌株含的質粒的不同，細菌的生長速度各不相同。因此為了達到理想的光密度，培養時間可略微長于或短于 2.5 h。

(4) 在培養液中添加 34 mg/ml 的氯霉素 2.5 ml，使其終濃度為 170 μg/ml。將此培養液于 37℃ 劇烈搖晃下繼續以 250 r/min 培養12~16 h。

(5) 取部分菌液（1~2 ml ) 到離心管中，4℃ 貯存備用。余下的菌液于 4℃ 以 2700 g ( 對于 Sorvall GSA 轉頭為 4100 r/min ) 離心 15 min 收獲。棄上清，倒置離心管使殘余的上清流盡。

(6) 用 200 ml 冰預冷的 STE 重懸細菌，按步驟 5 重新收集并將其貯存于 -20℃。

(7) 將步驟 5 貯存的 1~2 ml 菌液按小量提取法抽提質粒。采用酶切和瓊脂糖電泳分析此質粒，以確定大量培養的菌液中正確的質粒得以擴增。

設置這種對照可能看上去有點過于謹慎，然而它可以避免發生某些可能難以挽回的、浪費大量時間的錯誤。

(8) 將步驟 6 中凍存的細菌在室溫下放置 5~10 min 使其解凍，然后用 10 ml 預冷的 STET 重懸。將重懸液轉移到一個 50 ml 的 Erlenmeyer 燒瓶中。

2. 細胞的裂解

(1) 加入 1 ml 新配置的溶菌酶（10 mg/ml )。

(2) 用夾子夾住 Erlemneyer 燒瓶，在本生燈的明火上烤至液體開始沸騰。在加熱的過程中不停地搖動燒瓶。

警惕：在加熱過程中，不要讓燒瓶的開口對著自己或實驗室內的其他人。

(3) 迅速將燒瓶的下半部浸入到一大燒杯（2L ) 內的沸水中。將燒瓶在沸水中準確放置 40 s。

延長超螺旋 DNA 暴露于堿的時間會使其不可逆變性（Vinograd and Lebowitz 1996），所產生的環狀卷曲 DNA 不能被限制酶切割，而且它在瓊脂糖電泳中的遷移率為正常超螺旋 DNA 的兩倍，難以被溴化乙錠染色。從細菌中用堿裂解法提質粒時可能會看到微量的這種 DNA。

(4) 將燒瓶在冰水中放置 5 min，使之冷卻。

(5) 將燒瓶中黏稠的液體轉移到超速離心管中（BeCkman SW41 管或與其相當的管），于 4℃ 以 150000 g ( 或 Beckman SW41  Ti 轉頭，30000 r/min ) 離心 30 min。

起初的細菌培養物長得越密，在此步就越難將該黏稠狀裂解物轉移到離心管中。如有必要，可用長刃剪刀將裂解物剪成大小易于操作的團塊，或過 10 ml 注射器使之部分切開。從經氯霉素處理的細菌培養物中分離質粒 DNA 時，一般不會出現這一問題。

(6) 將上清盡量轉移到潔凈離心管中，棄去原離心管中殘留的黏荷液體。

若細菌碎片未能形成緊密的團塊，可以 210000 g（或 Bedtman SW41 Ti 轉頭，35000 r/min ) 再度離心 20 min，然后按上述方法轉移上清。

(7) ( 可選）若上清中含有可見的線狀基因組染色質或絮狀的蛋白質沉淀，在進行下面的處理之前可用四層紗布過濾（Huang and Campbell 1993）。

3. 質粒 DNA 的回收

(1) 測量上清的體積，將上清連同 0.6 倍體積的異丙醇一起移入一只潔凈離心管中，充分混勻，室溫下放置 10 min。

(2) 在室溫下以 12000 g ( Sorvall GSA 轉頭為 10000 r/min ) 離心15 min，回收沉淀下來的核酸。

若在 4℃ 下離心會使鹽也沉淀下來。

(3) 小心地棄去上清，將離心管敞開蓋倒置于紙巾上以除去殘余的上清。在室溫下用 70% 的乙醇漂洗管底及管壁，倒掉乙醇，并用連于真空管的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。將離心管開口倒置于紙巾上幾分鐘使剩余的乙醇揮發掉。此時沉淀應該仍然是濕的。

(4) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解核酸沉淀。

(5) 可用柱層析法、聚乙二醇沉淀法或 CsCl-溴化乙錠梯度離心法純化粗制的質粒 DNA。

(6) 用限制酶酶切及凝膠電泳分析確證質粒的結構。