基本方案 用于表達監測以及與寡核苷酸芯片雜交的 mRNA 擴增
備擇方案 cDNA 和體外轉錄產物的固相可逆固定（SPRI）純化
| 實驗方法原理 | 擴增步驟完全決定于干凈、完整的起始 RNA。對培養的細胞，作者采用胍鹽裂解再用樹脂純化（如 Qiagen RNeasy Kit）的方案。 擴增 mRNA 可從 Poly（A）＋或總 RNA 開始。盡管 poly（A）＋靈敏度更高，因為除 掉了 cDNA 反應期間大部分與 rRNA 的錯配，而使用總 RNA 起始則可以分析那些細 胞或組織有限的生物系統。使用總 RNA 起始一個重要的修正是將 cDNA 第一鏈合成的溫度從 37℃ 提高到 50℃。探針選擇嚴格限制在編碼區最后的 600 個堿基；除非 3'非翻譯區長度大于 800 個堿基，此時一些非翻譯序列可能也被包括進來了。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 樣品 RNA：poly（A）＋或總 RNA |
| 試劑、試劑盒 | SuperScript cDNA kit （Life Techologies） DTT 緩沖液 乙醇 |
| 儀器、耗材 | 熱循環儀 Lyophilizer （凍干機） Rotisserie 式搖床 50℃ 加熱爐 |
| 實驗步驟 |
1. 實驗前準備 1.1 材料 樣品 RNA：poly（A）＋或總 RNA，有義轉錄庫對照 1.2 試劑 SuperScript cDNA kit （Life Techologies） T7T24引物 RNA 酶抑制劑（Life Technologies 或 Ambion 公司） 無 RNA 酶水（DEPC處理過的水，玻璃蒸餾） 25：24：1 （V/V/V）酚：氯仿：異戊醇（分子生物學級） 7.5 mol/L 乙酸銨 無水乙醇 無 RNA 酶的 70％ 乙醇（預冷至 -20℃） 10×轉錄緩沖液（Ambion） 10×rNTP 混合液 100 mmol/L DTT 10 mmol/L Bio－ll－CTP 和 Bioll－UTP （Enzo Diagnostics） 2500 U/ul T7 RNA 聚合酶（Epicentre） RNeasy 小柱帶RLT和RPE 緩沖液及收集管（Qiagen） 5×片段化緩沖液 20×SSPE （Bio－Wh1ttaker） 0.5％ （V/V） Triton X－100 （分子生物學級；Sigma）溶于無 RNA 酶水 10 mg/ml 鯡精 DNA （Promega） 500 pmol/L Bio948 20×反義轉錄庫對照 6×SSPET： 6×SSPE 含有 0.005％ （V/V） Triton X－100 1.3 耗材 熱循環儀（例如 Perkin－Elmer 公司 9600 型 PCR 儀，帶熱蓋） 0.1～10 ul 帶濾芯槍頭（Continental） Lyophilizer （凍干機） 小薄壁PCR管 GeneChip （Affymetrix） 1～200 ul 帶濾芯凝膠上樣槍頭（Fisher） Rotisserie 式搖床（Appropriate Technical Resources） 50℃ 加熱爐 2. 在 PCR儀上設定下列程序： 10 min 70℃ 65 min 37℃ （用總 RNA 時 50℃） 150 min 15.8℃ 無限 4℃ （保溫） 3. 用下列試劑為每個RNA 樣品配 10 ul 第一鏈混合液，用帶濾芯的槍頭： 4 ul 5×第一鏈緩沖液 200 pmol T7T24 引物 1 ul RNA 酶抑制劑 1 ul 200 U/ul SuperScript Ⅱ 逆轉錄酶 加無 RNA 酶的水至 10 ul 4. 將每個RNA樣品與有義轉錄庫對照混合。每 1 ug poly（A）＋樣品加 5 ul 對照或每 10～20 總 RNA 加 1 ml 對照。冷凍干燥至每管體積小于 10 ul， 加無 RNA 酶的水 至10 ul。同時用手預熱第一鏈混合液。 5. 將每份 RNA 轉移到小薄壁 PCR 管中，放進 PCR 儀，啟動所設程序（第一步）。 6. 70℃ 那步完成后，在溫度降到 37℃（或 50℃）2 min 的時間里，加入預熱（手中）的第一鏈混合液（每管 10 ul）。 7. 在合適的反應溫度繼續保溫60 min。 8. 每管配制 130 ul 第二鏈反應混合液： 91 ul 無 RNA 酶的水 30 ul 5×第二鏈緩沖液 3 ul 10 mmol/L dNTP 1 ul 10 U/ul E.coli 連接酶 1 ul 2 U/ul E.coli RNA 酶 H 4 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 這個混合液可以先配制，在冰上至多放置 90 min。 9.當 PCR 儀溫度降到 15.8℃ 時，每管加入 130 ul 第二鏈反應混合液（總共 150 ul）。用槍頭反復吸放混勻，在此溫度下保溫＞2h。 10. 加入 2 ul 5 U/ul 的 T4 DNA 聚合酶繼續保溫 5 min。把樣品轉移到冰上。 11. 加入 150 ul 25：24：1 的酸：氯仿：異戊醇，渦旋混勻，室溫 13 000 g 離心 5 min。 12. 小心地將水相轉移到一個新的管子，不要吸到中間相。加入 70 ul 7.5 mol/L 乙酸銨和 0.5 ml 無水乙醇后混勻。室溫 13 000 g 離心 20 min。 13. 移去上清，沉淀用 0.5 ml 冷（-20℃） 70％ 乙醇洗滌，渦旋混合。 14. 室溫 13 000 g 離心 10 min。移去上清，沉淀空氣晾干幾分鐘。 15. 用 25 無 RNA 酶的水溶解 cDNA 沉淀并定量。 16. 每種 cDNA 樣品，按下面組分配制一個反應體系： 100 ng cDNA 6 ul 10×轉錄緩沖液 6 ul 10×rNTP混合液 3 ul 100 mmol/L DTT 2.4 ul 10 mmol/L Bio－ll－UTP 2.4 ul 10 mmol/L Bio－ll－CTP 2 ul RNA酶抑制劑 2 ul 2500 U/ ul T7 RNA 聚合酶 無 RNA 酶的水配平到 60 ul 冰上可以放至多 3 h，用前升溫到室溫。 17. 37℃ 保溫 8 h 至過夜。純化前可以在 -80℃ 放置至多 48 h。 18. 加入無 RNA 酶水至 100 ul， 加入 350 ul RLT 緩沖液，混勻。加入 250 ul 無水乙醇，混勻。 19. 將每個樣品上樣到一個套進收集管內的 RNeasy小柱上。臺式離心機室溫 8000 g 以上離心 15 s。 20. 將柱子轉到新的收集管，加入 500 RPE 緩沖液，臺式離心機室溫 8000 g 以上離 心 15 s。 21. 棄去流出液，將柱子重新放入此收集管。加入 500 ul RPE 緩沖液，臺式離心機以最大速度離心 2 min。 22. 把柱子轉移到一個新收集管。加入 50 ul 無 RNA 酶的水，8000 g 以上離心 1 min。 重復此步驟。合并兩次洗脫液。 23. 在 260 nm 用分光光度法測 RNA 的量。 24. 取 10 體外轉錄的 RNA 用無RNA酶的水將體積配到 24 ul。加入 6 ul 5×片段化緩沖液。小心混勻，在 PCR 儀上 95℃ 溫育 35 min。令其冷卻到室溫。-80℃ 可存放一年，用前 37℃ 融化 5 min。 25. 按下列組分為每個反應配 170 ul 雜交反應母液： 51 ul 20×SSPE 1.7 ul 0.5％ Triton X－100 1.7 ul 10 mg/ml 鯡精 DNA 20 ul 500 pmol/L Bio 948 10 ul 20×反義轉錄庫對照 85.6 ul 無 RNA 酶的水 26. 每份 30 ul 片段化的轉錄 RNA 加入 170 ul 雜交反應母液。在熱循環儀上以 99℃ 加熱 10 min， 再移到 37℃放置 5 min 以上。 27. 微量離心機最大轉速離心 5 min。 28. 從 GeneChip 的上層隔膜插入一個帶濾芯的槍頭形成出氣孔。從芯片的下層隔膜用帶濾芯的上樣槍頭加入 200 ul 雜交液。拿掉出氣孔，用保鮮膜覆蓋上下兩層。 29. 在 rotisserie 式旋轉儀上以 60 r/min 轉速 40℃ 保溫過夜（16～18 h）。 30. 將芯片轉入 50℃ 加熱爐，繼續旋轉芯片整整 1 h。 31. 從爐內拿出芯片。從上層隔膜處插入帶濾芯的槍頭。 32. 微量移液器按到底，將 200 ul 上樣槍頭從下層隔膜間插入。垂直拿起芯片，緩慢抽出所有雜交液并放進微量離心管內保存于 -20℃。 33. 將芯片內充滿 6×SSPRET。 34. 按廠商的說明書洗滌芯片并用藻紅素染色。盡快掃描芯片。
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| 注意事項 |
1. 許多緩沖液和酶附帶在 SuperScript cDNA 試劑盒里。附帶的酶量不足的話可以單獨從 Life Technologies 公司定購。 2. 所有需要控制溫度的反應都在適當的熱循環儀上進行。
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| 其他 |
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