用經典RACE擴增cDNA的5’末端實驗

GSP-RT 引物poly(A)+RNA 或總 RNA反轉錄緩沖液RNA 酶 HRNasinSuperScriptII 逆轉錄酶dNTP 溶液DTTTECoCl2dATP 溶液脫氧核苷酸末端轉移酶加尾緩沖液HerculesHot-Start 聚合酶HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液5'末端加尾的 cDNA 庫寡核苷酸引物

熱循環儀水浴或加熱儀Microcon-100 過濾器

第 1 階段：反轉錄產生 cDNA 模板

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

dNTP 溶液（含 4 種 dNTP，各 10mmol/L)

DTT(0.lmt)l/L)

TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5,1 mmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和緩沖液

反轉錄緩沖液，5X(制造商提供）

RNA 酶 H

RNasin

SuperScriptII 逆轉錄酶（Invitrogen)

3. 核酸和寡核苷酸

GSP-RT 引物（100ng/ul)

poly(A)+RNA 或總 RNA

4. 特殊設備

預設為 37°C、42°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加熱儀

二、方法

1. 在一個無菌的離心管中，于冰浴上混合以下轉錄成分。

反轉錄緩沖液，5X                                             4ul

dNTP 溶液（含 4 種 dNTP, 各 10 mmol/L)         1ul

DTT(0.lmol/L)                                                     2ul

RNasin(40U/ul)                                                   0.25ul

2. 在另一個管中，混合 0.5ul 的 GSP-RT 引物（100ng/ul) 和 lug poly(A)+RNA 或5ug 總 RNA，再加 13ulH20。80°C 溫育 3 min, 迅速在冰上冷卻，在離心機中離心 5s。

3. 將 RNA/引物混合物加入到反轉錄成分中，然后加 1ul(200U) 的 SuperscriptII 逆轉錄酶，溫和混勻，42°C 保溫 1h，然后 50°C 保溫 10min。

4.70°C 溫育 15 min，使逆轉錄酶失活，然后離心 5s。

5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H 到管中，37°C 溫育 20 min, 以破壞 RNA 模板。

6. 用 TE 將反應混合物稀釋至 40ul，4°C 保存（這就是 5'末端無尾 cDNA 文庫）。



第 2 階段：在第一鏈 cDNA 產物末端加 poly(A) 尾
一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

CoCl2(25 mmol/L)

dATP 溶液（1mmol/L)

TE(10 mmolTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和酶緩沖液

脫氧核苷酸末端轉移酶（Tdt)

加尾緩沖液，5X(125 mmol/LTris-HCl、pH6.6，lmol/L 二甲胂酸鉀，1250ug/ml BSA)

3. 特殊設備

Microcon-100 過濾器（Millipore) 或起相同作用的其他產品

預設為 37°C、65°C 的水浴或加熱儀

二、方法

1. 用 Microcon-100 過濾器（Millipore) 或起相同作用的其他產品，去除 5'末端無尾cDNA 文庫（由上面第 1 階段第 2 步得到）中的過量引物，按說明進行操作，并用 TE 洗兩次以上，總體積不要超過 15ul，用水將總體積調整至 15ul。

2. 加 4ul 的 5X 加尾緩沖液和 10U 的 Tdt。

3.37°C 保溫 5 min, 然后 65°C 溫育 5 min。

4. 用 TE 將體積稀釋至 500ul, 保存于 4°C(這就是 5'末端加尾 cDNA 文庫）。



第 3 階段：擴增
一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

dNTP 溶液（含 4 種 dNTP，各 10 mmol/L)

TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,1mmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和酶緩沖液

HerculesHot-Start 聚合酶（Stratagene)

HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液（10X)

3. 核酸和寡核苷酸

5'末端加尾的 cDNA 庫（由上面第 2 階段得到）

寡核苷酸引物 Qo、QT 和 GSPl(Q0 和 QT 的序列見圖 25-2)

4. 特殊設備

可設程序的熱循環儀

二、方法

1. 第一輪

(1) 在一個無菌的 0.2 ml 離心管中混合以下成分。

HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液（10X)      5ul

dNTP 溶液（10 mmol/L)                            1.0ul

Hercules Hot-Start 聚合酶                         2.5U

H20                                                            至 50ul

(2) 加 1ul 的 5'末端加尾 cDNA 文庫（來自第 2 階段第 4 步）和 GSP1,Q0[見圖 25-2(b)] 和 QT 引物各 25pmol。

(3) 混勻并在 DNA 熱循環儀上 98°C 加熱 5 min, 使第一鏈產物變性，并激活聚合酶。冷卻至 48°C 退火 2 min, 然后 72°C 延伸 40 min。

(4) 按下列程序進行 30 個擴增循環。



2. 第二輪

(5) 取出部分第一鏈擴增產物，用 TE 以 1:20 稀釋。

(6) 用上面的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 mm 的延伸步驟，用 Q1 引物和 GSP2 引物擴增 1ul 上述稀釋材料。