用纏繞法從哺乳動物細胞中分離DNA

λ 噬菌體的線性單體和多聯體 哺乳類細胞、新鮮組織或血樣

細胞裂解液 乙醇 TE

脈沖電場凝膠或 0.6% 瓊脂糖凝膠 Kimwipe 吸水紙 聚丙烯管 振蕩平臺 Shepherd 氏鉤 寬口移液管

一、材料

1. 緩沖液和溶液

細胞裂解液（6 mol/L 鹽酸胍，0.1 mol/L 醋酸鈉（pH 5.5)）

乙醇（室溫）

TE ( pH 8.0)

2. 凝膠

脈沖電場凝膠或 0.6% 瓊脂糖凝膠

3. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌體的線性單體和多聯體

4. 專用設備

Kimwipe 吸水紙

聚丙烯管（50 ml)

振蕩平臺

Shepherd 氏鉤（替代透析的一種選擇）

寬口移液管（開口處直徑 0.3 cm)

5. 細胞和組織

單層或者懸浮培養的哺乳類細胞、新鮮組織或血樣

二、方法

1. 制備細胞懸液（或冰凍細胞粉末）的裂解液。

2. 采用下面兩種方法之一制備細胞裂解液。

(1) 從懸浮培養液裂解細胞

① 將細胞懸液轉移至一次性聚丙烯離心管。

② 加 7.5 倍體積細胞裂解液。

(2) 從組織裂解細胞

① 將冰凍細胞粉末一點一點加入盛有約 7.5 倍體積細胞裂解液的燒杯，使其分散于裂解液表面，而后振搖燒杯使粉末浸沒。

② 待所有材料溶解，將溶液轉移至離心管。

3. 關上離心管蓋，室溫中在振搖平臺上溫育 1 h。

4. 在一系列一次性 50 ml 聚丙烯離心管中加入 18 ml 處于室溫的乙醇。使用寬口移液管小心地使細胞懸液處于乙醇之下。

5. 用 Shepherd 氏鉤緩慢攪拌細胞裂解液和乙醇間的界面以回收 DNA。DNA 將黏附在鉤上形成膠狀物。繼續攪拌直至乙醇和水相完全混合。

6. 將黏附有 DNA 的 Shepherd 氏鉤轉移至另一含有 5 ml 室溫乙醇的聚丙烯管中。將 DNA 浸入乙醇直至完成所有樣品。

7. 移出黏附有 DNA 的每個 Shepherd 氏鉤，盡量使乙醇滴干。至此，DNA 收縮成緊密的脫水團塊。通常將鉤的 U 型末端與 Kimwipe 吸水紙接觸，便可通過毛細管作用去除大部分游離乙醇。當 DNA 上的乙醇尚未蒸發完全時，將鉤轉移至另一新的聚丙烯管，里面盛有 5 ml 處于室溫的乙醇。

8. 當全部樣品處理完畢，盡可能去除乙醇。

9. 將每個吸管轉移至盛有 1 mI TE 緩沖液（pH8.0) 的新聚丙烯管中。于 4℃ 過夜，使 DNA 重新水合。

10. 在水合過程中，DNA 將呈高度凝膠狀，但仍黏附于吸管上。用另一新 Shepherd 氏鉤做刮刀，溫和地將 DNA 沉淀從吸管上刮下來。棄去吸管，讓 DNA 沉淀漂浮于 TE 中。蓋上管蓋，于 4℃ 在振搖平臺上溫育直至 DNA 沉淀完全溶解（約 24~48 h)。

11. 在脈沖凝膠電泳或者 6% 瓊脂糖凝膠上分析。