這一程序改自最先由 Daryl Stafford 及其同事描述的方法（Blin and Stanfford 1976)。 當需要大量哺乳動物 DNA，如用于 Somhern 雜交或者用噬菌體 λ 載體構建基因組文庫時，應選用這一方法。從 5X107 培養的非整倍體細胞 ( 如 HeLa 細胞）中可獲得大約 200 μg，長度為 100~150 kb 的哺乳動物DNA。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯
| 實驗方法原理 | 這一程序改自最先由 Daryl Stafford 及其同事描述的方法（Blin and Stanfford 1976)。 當需要大量哺乳動物 DNA，如用于 Somhern 雜交或者用噬菌體 λ 載體構建基因組文庫時，應選用這一方法。從 5X107 培養的非整倍體細胞 ( 如 HeLa 細胞）中可獲得大約 200 μg，長度為 100~150 kb 的哺乳動物DNA。 |
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| 實驗材料 | 蛋白酶 K噬菌體 λ DNA哺乳動物細胞、新鮮組織或者血樣 |
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| 試劑、試劑盒 | 醋酸銨透析緩沖液乙醇裂解緩沖液苯酚TETris-緩沖鹽溶液 |
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| 儀器、耗材 | 脈沖電場凝膠或傳統的水平 0.6% 瓊脂糖凝膠Sorvall 離心機及 H1000B、SS-34 轉頭尖頭切斷的黃色尖頭透析管夾振蕩平臺或透析管Shepherd 氏鉤分光光度計或熒光計旋轉器真空抽干儀水浴寬口移液管 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
醋酸銨（10 mol/L) (替代透析的一種選擇，步聚 9)
透析緩沖液（替代乙醇沉淀的一種選擇，步驟 9)（50 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0)，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)，準備 4 份 4 L 透析液并于 4℃ 保存）
乙醇（替代透析的一種選擇，步驟 9)
裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，0.1 mol/L EDTA( pH 8.0），0.5% (m/V) SDS，20 μg/mg 無 DNase 的胰 RNase）
苯酚，用 0.5 mol/L Tris-Cl ( pH 8.0) 平衡
TE ( pH 8.0)
Tris-緩沖鹽溶液（TBS)
2. 酶和緩沖液
蛋白酶 K ( 20 mg/ml)
3. 凝膠
脈沖電場凝膠或傳統的水平 0.6% 瓊脂糖凝膠
4. 核酸和寡核苷酸
完整的噬菌體 λ DNA
5. 離心機和轉頭
Sorvall 離心機及 H1000B、SS-34 轉頭（或其他相當的設備）
6. 專用設備
尖頭切斷的黃色尖頭
透析管夾
振蕩平臺或透析管
Shepherd 氏鉤（替代透析的一種選擇）
分光光度計或熒光計
旋轉器
真空抽干儀
50℃ 水浴
寬口移液管（開口處直徑 0.3 cm)
7. 細胞和組織
單層或懸浮培養的哺乳動物細胞、新鮮組織或者血樣
二、方法
以下是 4 種裂解不同類型細胞和組織樣品不同版本的步驟 1。根據研究材料選用合適的方法裂解后步驟 2 。
1. 單層培養細胞的裂解
最好一次做 10~12 個培養皿，其余的保存在孵箱中，用前取出。
(1) 長滿單層細胞的一批培養皿從孵箱中取出，迅速吸去培養液，并用冰冷的 TBS 洗 2 次。小心加入 10 ml TBS, 輕輕旋轉數秒，將溶液倒入 2 L 燒杯中。加入 10 ml 冰冷的 TBS 并置于冰上。重復此過程將整批細胞做完。
(2) TBS 溶液倒入 2 L 燒杯，并吸去剩余的溶液。加入 1 ml 新鮮的冰冷 TBS, 并將培養皿置于冰上。重復此過程將整批細胞做完。
(3) 用一橡膠刮棒將細胞刮入 1 ml TBS 中。用巴斯德移液管將細胞懸液轉移到冰上的離心管中。用 0.5 ml 冰冷的 TBS 沖洗培養皿，并入離心管中的細胞懸液。重復此過程將整批細胞做完。
(4) 于 1500 g ( 約 2700 r/min ) 離心 10 min 以收集細胞。
(5) 將細胞重懸于 5~10 倍體積的冰冷 TBS 中并再度離心。
(6) 用 TE ( pH 8.0 ) 重懸細胞至濃度為 5X107 個/ml, 轉移至一個三角錐瓶中。
(7) 每毫升細胞懸液加 10 ml 裂解緩沖液，并于 37℃ 孵育 1 h, 立即進行步驟 2。
2. 懸浮培養細胞的裂解
(1) 將細胞轉移至離心管并于 4℃ 1500 g ( Sorvall H100B 轉頭，2700 r/min ) 離心 10 min 以收集細胞。吸去上清。
(2) 用 1 倍體積冰冷的 TBS 重懸細胞并再度離心。吸去上清，小心地再次重懸細胞于冰冷的 TBS 中，離心收集細胞。
(3) 去上清，小心用 TE ( pH 8.0) 重懸細胞至 5X107 個/ml, 轉移上清至三角錐瓶。
(4) 每毫升細胞懸液加 10 ml 裂解緩沖液，并于 37℃ 溫育 1 h, 立即進行步驟 2。
3. 組織樣品的裂解
由于組織通常含有大量纖維物質，很難從中獲得高產量的基因組 DNA。在裂解之前將組織粉碎極大地提高抽提效率。大量的新鮮組織（>1 g）可用 Waring 攪拌器粉碎。
組織樣品的研磨
(1) 將 1 g 新鮮切取的組織樣品置于盛有液氮 Waring 攪切器的不銹鋼杯中，以最高速度將組織粉碎。
(2) 液氮揮發，將組織粉末一點一點地加入盛有 10 倍體積（m/V) 裂解液的燒杯中，使其分散于裂解液表面，而后振搖燒杯使粉末浸沒。
(3) 其完全分散于溶液中，將懸液轉移至 50 ml 離心管，并于37℃ 溫育 1 h, 立即進行步驟 2。
4. 新鮮抽取或凍存血細胞的裂解
(1) 從新鮮抽取或凍存樣品中收集血細胞（人類血液需由熟練的采血師在無菌環境下抽取）
從新鮮血樣中收集血細胞
① 收集 20 ml 新鮮血液于含有 3.5 ml 檸檬酸葡萄糖溶液 B (ACD) 或者 EDTA 的小管中。
② 血樣轉移至離心管并于 4℃ 1300 g ( Sorvall H100B 轉頭，2500 r/min) 離心 15 min。
③ 吸去上清。用巴斯德移液管將淡黃色層小心轉移至新管中并再次離心。棄去紅細胞沉淀。
淡黃色層為密度不均一的白細胞寬帶。
④ 將淡黃色層重懸于 15 ml 裂解緩沖液中，并于 37℃ 溫育 1 h, 然后進行步驟 2 。
從凍存血樣中收集血細胞
① 收集 20 ml 新鮮血液于含有 3.5 ml 檸檬酸葡萄糖溶液 B (ACD) 或者 EDTA 的小管中。
血樣可于 0℃ 保存數天并于 -70℃ 無限期保存。
② 室溫水浴中解凍血樣并轉移至離心管，加入等體積磷酸鹽緩沖液。
③ 于室溫 3500 g ( Sorvall SS-34 轉頭，5400 r/min) 離心 15 min。
④ 吸去含有裂解紅細胞的上清。將沉淀重懸于 15 ml 裂解緩沖液。并于 37℃ 溫育 1 h, 然后進行步驟 2。
用蛋白酶 K 和苯酚處理細胞裂解液
2. 將裂解液轉移至一個或者多個適合 Sorvall SS-34 轉頭的離心管中，裂解液不能超過 1/3 體積。
3. 加入蛋白酶 K ( 20 mg/ml) 至終濃度 100 μg/ml。用一玻棒溫和地將酶混入黏滯的細胞裂解液中。
4. 將細胞裂解液置于 50℃ 水浴中 3 h, 不時旋轉黏滯的溶液。
5. 將溶液冷卻至室溫，加入等體積的用 0.1 moI/L Tris-Cl (pH 8.0) 平衡過的苯酚。將離心管置于旋轉器上，使離心管緩慢顛轉 10 min 以溫和地混合兩相。如此時兩相未能形成乳濁液，則將離心管置于旋轉器上 1 h。
6. 室溫 5000 g ( Sorvall SS-34 轉頭，6500 r/min ) 離心 15 min 以分離兩相。
7. 用寬口移液管（出口直徑 0.3 cm）將黏滯的水相轉移至另一離心管。
8. 用苯酚再抽提兩次，收集水相。
9. 用以下 2 種方法之一分離 DNA。
(1) 分離大小為 150~200 kb 的DNA
① 將水相轉移至透析袋，透析袋頂部用透析管夾封口，袋中留有使樣品體積增加 1.5~2 倍體積的空間。
② 于 4℃ 在 4 L 透析緩沖液中透析，其間換 3 次緩沖液，每次間隔 6 h。
由于 DNA 黏性很高，透析通常要超過 24 h 才能完成。
(2) 分離平均大小為 100~150 kb 的DNA
① 第三次用酚抽提后，將水相轉移至另一離心管中 0.2 倍體積 10 mol/L 醋酸銨及 2 倍體積乙醇，旋轉離心管直至溶液徹底混勻為止。
② DNA 隨即形成沉淀。用 Shepherd 氏鉤（末端封口并拉制成 U 型的巴斯德移液管) 將 DNA 沉淀從乙醇溶液中移出，污染的寡核苷酸仍留在其中。
③ 如果 DNA 沉淀成為碎片，不用 Shepherd 氏鉤而在室溫 5000 g 離心 5 min 收集沉淀。
④ 用 70% 乙醇洗滌 DNA 沉淀 2 次，按步驟 ③ 離心收集 DNA。
⑤ 盡可能用真空泵吸去殘余的乙醇。于室溫將 DNA 沉淀置于敞開的管內，直至可見的痕量乙醇揮發殆盡。
不要使 DNA 沉淀完全干燥，否則 DNA 將極難溶解。
⑥ 按每 0.1 ml 細胞（步驟 1) 加入 1 ml TE。將其置于搖床平臺上，于 4℃ 溫和振搖 12~24 h 直至 DNA 完全溶解。將 DNA 溶液儲于 4℃。
10. 測定 DNA 的濃度。
11. 用脈沖凝膠電泳或者常規的 0.6% 瓊脂糖凝膠電泳分析制備的高分子質量 DNA 的質量。用 λDNA 單體或者線性多聯體作為分子質量標記物。
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