用PCR來制備編碼隨機肽的雙鏈DNA文庫實驗

限制性內切酶和緩沖液滅菌雙蒸水Tris-HCl生物素標記的 PCR 引物

鏈霉抗生物素蛋白磁性珠瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

滅菌雙蒸水（ddH₂0)

10 mmol/LTris-HCl，pH8.0

2. 酶和酶緩沖液

限制性內切酶和緩沖液（見第 9 步）

10XVent 緩沖液

VentDNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

生物素標記的 PCR 引物，長度至少 15bp,5'末端進行了生物素修飾（見圖 26-1)。



編碼 12 個氨基酸的 NNK 庫。庫的設計如圖 26-1(a) 所示。

合成的鏈含有一個隨機多肽庫，它們的 3'末端和 5‘末端都加了一個特定的側翼序列，作為引物結合的位點，并且含有限制性內切酶的識別位點，以方便將文庫 DNA 克隆進合適的載體系統。側翼序列長度至少應該有 15bp，并且設計時應該有 3 個標準：1.它們應該是有效的 PCR 引物結合位點；2.它們應該含有后續克隆步驟所需的限制性酶切位點（可選：限制性酶切位點可以位于 PCR 引物 5’端與文庫寡核苷酸的重疊區，而不要位于文庫寡核苷酸內部），3.因為一端或兩端的便翼 DNA 序列有可能在肽庫中代表氨基酸，它們應該不包含影響文庫功能的密碼子。在合成文庫的編碼區過程中，每個密碼子的前兩個位點中，4 種核苷酸的含量是相等的，而在第三個位點，G+T 的比例是 1:1[圖 26-1（a)]。在第三個位點不使用 A 和C 核苷酸，減少了形成終止密碼子的可能，但仍允許編碼 20 種氨基酸。

dNTP(各 20 mmol/L)

4. 其他

瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠 (見第 11 步）

QIAprep Miniprep silica column(QIAGEN)

鏈霉抗生物素蛋白磁性珠（Dynal)

二、方法

1. 第一輪聚合反應：文庫的 PCR 擴增

（1）進行下列反應，將單鏈的合成寡核苷酸，擴增為有效的構建文庫的起始材料。下面所給的是 100ul 體系的用量。要構建大規模的庫，準備 1 ml 的反應物，并將它們平分到 10個獨立的 PCR 管中。

10pmol 的文庫寡核苷酸

2U 的 Vent DNA 聚合酶

生物素標記的 PCR 引物，各 100pmol

10ul 的 10XVent 緩沖液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP，各 1ul

用 ddH₂O 定容至 100ul

（2）在一個熱循環儀中，94°C 將混合物預熱 20s。

（3）按下面的參數進行 30 輪 PCR 循環。

94°C10s

55°C10s(或用引物的合適退火溫度）

72°C15s

（4）冷卻至 4°C。

2. 第二輪聚合反應：合成配對的雙鏈文庫 DNA.

（5）在每 100ul 第一輪反應產物中，加入 10ul 的 10X 反應緩沖液、100pmol 的各引物、2U 的 Vent DNA 聚合酶。

（6）進行一個單輪的循環：94°C 30s，55°C 30s，72°C 15s。

（7）冷卻至 4°C。

（8）用 QIAprep 的柱子純化第二輪擴增產物，并用 10mmol/L Tris(pH8.0) 洗脫。

（9）用合適的內切酶消化洗脫產物（圖 26-2，第 1 泳道），然后用乙醇沉淀 DNA, 并用ddH₂O 溶解（Sambrook and Russell2001)。經過這一消化反應，生物素標記的 DNA 末端將從文庫的核心釋放出來。

（10）用鏈霉抗生物素蛋白磁性珠去掉生物素標記的 DNA 末端（Korn et al.1992)。這一步驟將增加目的連接產物的產量，因為這些末端能夠與文庫插入片段或表達載體相連接。鏈霉抗生物素蛋白的親和步驟，同時能去掉任何沒有酶切或部分酶切的 PCR 產物（圖 26-2,第 3 泳道和第 4 泳道）。

（11）在 4% 的瓊脂糖凝膠上，分析反應中間產物和終產物。終產物（圖 26-2, 第 4 泳道）是高純度且高度復雜的雙鏈文庫 DNA，有突出的末端，可以直接連接到合適的表達系統上。