大規模純化
| 實驗方法原理 |
對于很多研究，部分純化的病毒就足夠了（進行到本實驗步驟 14）， 如果是純化 MVA 病毒，則不能用胰酶消化，也不能用 CEF 細胞或 BHK-21 細胞代替 HeLa 細胞。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 痘苗病毒儲液 HeLa S3 細胞（懸浮培養） |
| 試劑、試劑盒 | 胰酶 Tris ? Cl 蔗糖 |
| 儀器、耗材 | 旋轉搖瓶完全培養基-5 帶緊杵的 2 L 通氣旋轉搖瓶 杜恩斯勻漿器（帶緊杵） 杯狀超聲儀Beckman 超速離心機 無菌離心管（SW27 或 SW28 轉頭） 分光光度計 |
| 實驗步驟 |
1. 使用前將等體積的疸苗病毒儲液和 0.25 mg/ml 的胰酶混合，用力振蕩。37℃ 水浴溫育 30 min，在溫育過程中每隔 5～10 min 渦旋振蕩一次。 2. 用血球計數器對 HeLa S3 細胞計數（附錄 3F）。 3. 將 5 × 108 的 HeLa S3 細胞轉移至離心管中，室溫 1800 g 離心 10 min，棄上清。 4. 然后按 2 × 107 細胞/ml 的濃度用旋轉搖瓶完全培養基-5 重懸細胞。 5. 按 5～8 pfu/細胞（MOI）將消化過的病毒加到細胞懸液中，攪拌溫育 30 min。 6. 將細胞轉移至裝有 1 L 旋轉搖瓶完全培養基-5 的通氣旋轉搖瓶中，攪拌培養 2～3 天。 7. 5～10℃，1800 g 離心 5 min，棄上清。 8. 將細胞懸浮于 14 ml 的 10 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液中。以下步驟中樣品均需置于冰上。 9. 用杜恩斯勻漿器經過 30～40 次的擊打將細胞懸液均質化，通過顯微鏡檢査細胞的破碎情況。 10. 5～10℃，300 g（H-6000A 轉子中為 900 r/min）離心 5 min 以去除核，保留上清。 11. 將細胞沉淀懸浮于 3 ml 的 10 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液。5～10℃，300 g 離心 5 min，保留上清，并與步驟 10 中的上清合并。 12. 對上清（溶解產物）進行超聲處理，整個過程都應保持溶解產物低溫，按照下面的步驟用杯狀的超聲儀進行超聲。 12.1 將樣品按每份 3 ml 進行分裝，分別超聲處理。 12.2 將杯中裝滿冰水混合物（50％ 的冰），將裝有溶解產物的管子置于冰水混合物 中，用最大功率超聲 1 min。 12.3 重復超聲 3 或 4 次，每次超聲后將溶解產物置于冰上 ≥ 30 s。 13. 將溶解產物加到盛有 17 ml 36％ 蔗糖墊層的無菌 SW27（或 SW28）離心管中。 4℃，32900 g 離心 80 min。將上清吸出丟棄。 14. 將病毒沉淀懸浮于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液中。到這一步純化出的病毒對于某些用途，比如分離 DNA，其純度已經足夠了。 15. 按照步驟 12 的方法超聲 1 min。 16. 在使用的前一天制備無菌的 24％～40％ 的持續蔗糖梯度，分別小心地將 6.8 ml 的 40％、36％、32％、28％ 和 24％ 的蔗糖溶液加到無菌的 SW27 離心管中。在冰箱中靜置過夜。 17. 將 1 ml 超聲過的病毒沉淀（來自步驟 15）加到蔗糖梯度的上層。4℃，26000 g 離心 50 min。 18. 可見乳白色的病毒帶出現在離心管的中部。將病毒帶以上的蔗糖溶液吸棄，小心地用無菌槍頭將病毒帶（約 10 ml）收集于一個無菌管中保存。 19. 將剩余的蔗糖溶液吸出后收集聚集于蔗糖梯度底部的病毒聚合物。上下抽吸將病毒沉淀重懸于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris ?Cl 溶液中。 20. 按照步驟 12 的方法超聲 1 min。 21. 重復步驟 16～18 的操作，收集病毒帶，與步驟 18 所收集的病毒溶液合并。加入兩 倍體積的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液混合，轉移至無菌的 SW27 離心管中。溶液總體積應有 60 ml，足夠裝滿兩個 SW 27 離心管。如果得到的體積較少，用 1 mol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液補滿離心管。 22. 4℃，32900 g 離心 60 min，吸棄上清。 23. 將病毒沉淀重懸于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液中，按照步驟 12 的方法超聲，然后按每份 200～250 μl 進行分裝。留一份進行步驟 24 操作，其余的凍存于 -70℃。 24. 用分光光度計在 260 nm 處對未凍存的病毒樣品進行定量，以此確定提取痘苗病毒 DNA 時所需要的病毒量（見輔助方案 2）。 25. 將病毒懸液在冰上超聲 20～30 s（見步驟 12），然后進行 10 倍系列稀釋，直至 10-10。用 10-8、10-9 和 10-10 這 3 個稀釋度去感染 6 孔板中培養的單層生長至匯片 的 BS-C-1 細胞，每個稀釋度做雙份。
展開 |
| 注意事項 |
1. 病毒儲液的滴度通常為 2 × 109 pfu/ml，但不同來源的病毒儲液的滴度也許會遠低于這個滴度。 如果有可見的結團存在，冷卻到 0℃，并在冰上超聲 30 s。超聲可重復數次，但兩次超聲之間樣本應置冰上冷卻。 2. 步驟 12.3 中，因為超聲過程會使冰融化，所以應向杯中重新加入冰。 3. 一個光密度單位是 1.2 × 1010 個病毒顆粒，即是（2.5～5）× 108 pfu。由于光的散射、不吸光，在不同的分光光度計上這個值也許會有輕微的不同。
展開 |
山東博納生物科技集團有限公司（以下簡稱“博納生物”）宣布完成A輪融資，融資總額近億元人民幣。本輪融資由魯信創投領投，濟高財金跟投，生命資本擔任獨家財務顧問。本輪投資者對博納生物的發展前景深具信心，將通......
記者從中國科學院長春應用化學研究所了解到，該所綠色分離化學與清潔冶金課題組在廢舊動力鋰電池分離回收新工藝上取得新突破。課題組負責人陳繼介紹，我國動力鋰電池生產、使用和出口均居世界前列。鋰電回收和循環利......
介紹在抗體藥物純化工藝中，通常采用經典的三步或兩步層析法，蛋白A（ProteinA）親和介質（填料）因其配基上有多個區域對抗體Fc片段具有特異性吸附能力，因此廣泛用于抗體捕獲步驟（第一步層析）。通過一......
藥物的分離純化是從合成或天然來源中獲得的藥物混合物中，將目標化合物純化為高純度的過程。這是藥物研發和制造過程中非常重要的步驟，因為高純度的藥物確保了其安全性和有效性。藥物的分離純化通常涉及以下一般步驟......
“玩了一輩子沙子”，這是艾捷博雅生物集團董事長汪群杰對自己的描述。從研究生、博士到博士后，汪群杰一直在做有機硅材料，入職安捷倫后開始接觸色譜分離材料，在以硅材料為核心的分離材料上有深厚的沉淀。從安捷倫......
近日，中國科學院上海有機化學研究所質譜引導的SFC/UFPLC切換高通量自動純化系統采購項目公開招標。項目編號：OITC-G220300352項目名稱：中國科學院上海有機化學研究所質譜引導的SFC/U......
融膠液，可以使瓊脂糖凝膠完全融化。同時采用了一種新型的離子交換柱，在特定條件下，使DNA能在離心過柱的瞬間，結合到DNA純化柱上，在一定條件下又能將DNA充分洗脫，從而實現DNA的快速純化。1.低熔點......
PCR產物的直接純化：一、原理PCR產物一般都含有過量的引物、TaqDNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續的酶切、雙脫氧PCR測序反應等過程,因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多,商用......
蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛，要利用不同蛋白間內在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染，而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。圖片來源于網絡根據蛋......
分析測試百科網訊2019年4月3日，艾杰爾-飛諾美第1000臺CHEETAH交付儀式在寧波康龍化成舉辦。本次交付的第1000臺純化儀器是CHEETAHII快速中壓純化色譜，是歷經十年頗受好評的CHEE......