砷鉬酸比色法測定還原糖含量

一、目的
植物體內的還原糖主要是葡萄糖、果糖和麥芽糖。它們在植物體內的分布，不僅反映植物體內碳水化合物的運轉情況，而且也是合成其它成分碳架來源和呼吸作用的基質。此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鑒定其品質的重要指標。其它碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，經水解也生成還原糖。因此，測定還原糖的方法在研究植物體內生理生化變化和測定植物體內碳水化合物方面都是很重要的。
二，原理；
還原糖是具有羰基（>C=O）的糖，能將其它物質還原而其本身被氧化。
(1) 還原糖在堿性條件及有酒石酸鉀鈉存在下加熱，可以定量地還原二價銅離子為一價銅離子，產生磚紅色的氧化亞銅沉淀，其本身被氧化。具體反應如下：

（2）氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還原，還原型的鉬酸銨再與砷酸氫二鈉起作用，生成一種藍色復合砷鉬藍，其顏色深淺在一定范圍內與還原糖的含量（即被還原的Cu₂O 量）成正比，用標準葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后做標準，就可測得樣品還原糖含量。

三、實驗材料、主要儀器和試劑

1．實驗材料
蘋果、面粉等
2．主要儀器
（1）分光光度計
（2）水浴鍋
（3）具塞刻度試管：20mL×10
（4）刻度吸管：1 mL×1，2 mL×4，5 mL×3
（5）容量瓶：100 mL×2
（6）漏斗
（7）研缽
3．試劑
（1）銅試劑：
A、4％CuSO45H2O
B、稱取24g 無水碳酸鈉，用850mL 水溶于大燒杯中，加入2g 含4 分子結晶水的酒石酸鉀鈉，待全溶（應加熱）后加入碳酸氫鈉16g，再加入120g 無水硫酸鈉（加熱），全溶及冷卻后加水至900mL，沉淀1～2d，取上清液（要求嚴格時過濾）備用。使用前將A 與B 按1∶9 混勻即可使用。
（2）砷鉬酸試劑：25g 鉬酸銨 ( NH4)6Mo7O24·4H2O 溶于450mL 蒸餾水中（加熱溶解，但溫度接近150℃時易分解），待冷卻后再加入21mL 濃H2SO4 混勻。另將3g 砷酸氫二鈉(Na2HasO4·7H2O)溶解于25mL 蒸餾水中，然后加到鉬酸銨溶液中，室溫下放置于棕色瓶中可長期使用。
（3）200μg／mL 標準葡萄糖原液：準確稱取分析純葡萄糖200mg，溶解定容到1000mL。
四、操作步驟
1．標準曲線的制作：
在一系列刻度試管中，分別加入200μg／mL 標準葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL，再順序加入蒸餾水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 及1.4 mL，配成濃度分別為0、10、20、30、40、50 及60μg/mL 的系列葡萄糖溶液。每試管加入銅試劑2mL，混勻后沸水浴中加熱10min，立即冷卻，再加入2mL 砷鉬酸試劑，振蕩兩分鐘后稀釋到20mL，用分光光度計在620nm 波長下比色，測其光密度OD620nm（做一式兩份）。以糖濃度微克數為橫坐標，光密度OD620nm 為縱坐標，繪制標準曲線。
2．植物樣品中還原糖的提取：
將樣品洗凈，吸干其表面水分，切碎混勻，稱取1g 放入研缽中，加入約0.5g 石英砂，磨成勻漿，加水將樣品由玻璃漏斗沖入100mL 容量瓶中，加水達70～80mL，搖勻后置于80℃恒溫水浴上浸提0.5h。
待上述樣品冷卻后，沉淀蛋白質，加入5％硫酸鋅5mL，再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL，以沉淀蛋白質。振蕩后靜置，至上層出現清液后再加一滴Ba(OH)2，直至無白色沉淀時，向容量瓶加水至刻度。
3．還原糖含量的測定：
過濾上述已定容的樣品液，取5mL 濾液，再定容到100mL（此步視樣品的含糖量而定）。取已稀釋的溶液2mL，與標準葡萄糖顯色法相同：加銅試劑2mL，煮沸10min，加砷鉬酸試劑 2mL，振蕩2mL，定容到15ml，620nm 波長下比色，記下光密度OD620nm（至少重復兩次）。
五，結果計算

式中：G 從標準曲線上查得含糖量（μg）。