從孕17-18天的雌鼠的胎兒分離神經元細胞。孕雌鼠麻醉然后解剖，胎兒收集到HBSS-1中然后快速斷頭。剝離腦膜和白質后，大腦皮質收集入 HBSS-2 液中機械磨碎。皮質碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中37°C消化15分鐘。胰酶消化后，細胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液沖洗兩次，用神經基礎培養液重懸細胞（培養液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/mL慶大霉素）。以1×105cell/cm2接種到事先用多聚賴氨酸包被的培養皿上，放到37°C，5%CO2濕溫培養箱里進行培養。每3天用吸管換液，一次換0.5mL。體外培養8天細胞就能用于實驗。
選用17-18天的胎鼠能夠提高神經元培養的效率，因為與乳鼠相比胚胎組織的細胞連接還很少。因此，用乳鼠會使神經元的分離更加困難，會造成細胞連接不可逆的損傷，細胞之間的共同的軸突和樹突更容易發生損傷。另外，用出生后1天內的大鼠皮質培養容易有膠質細胞污染，而用胎鼠則可以避免這種情況。如果用的是乳鼠，一般是在培養36個小時后加入阿糖胞苷，抑制膠質細胞生長。
另外，如果把分化的影響看成是考慮的重要因素，可以用培養4天的、8天的、18天的細胞。其中一個例子可以是觀察毒性物質對小孩和成年的不同效應。
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