| 試劑、試劑盒 | 固定劑 溫育液 氯霉素 放射自顯影乳劑 顯影劑 SDS樣本緩沖液 |
|---|---|
| 實驗步驟 |
一、放射自顯影
神經元在條件培養基中培養 2d，如第十章所述。
1.用一個鋒利的微電極從胞體分離神經突起，并用牽引電極將胞體移出培養皿 (見第十章)。
2.在培養液中加入終濃度 0.lmmol/L 氯霉素，阻斷線粒體蛋白的合成。
3.小心移去培養液并用溫育液洗滌 6 次，每次 Imin。保證軸突始終被一小部分液體覆蓋；一旦干了，軸突便會崩解。
4.在含 0.5mCi/ml 反式-35S 和 0.1 mmol/L 氯霉素的溫育液內標記 30 min。
5.用含 lmol/L 未標記半胱氨酸和蛋氨酸以及 0.1_d/L 氯霉素的溫育培養液洗漆 6 次，每次 40 min。
6.用 1% 的多聚甲醒和 1% 的乙酸固定 2 h。
7.用一系列濃度遞增乙醇脫水。
8.于空氣中干燥。
9.浸入放射自顯影乳劑。
10.曝光 2~7 山具體時間根據 35S 標記摻入蛋白的速度而定。
11.D19 中顯影。
12.水中短暫漂洗。
13.20%Na2S2O3(硫代硫酸鈉）水溶液固定。
14.水洗漆 20 min。
15.封片液或甘油封片。
二、聚丙烯酰胺凝肢電泳
1.從胞體分離神經突起并去胞體。
2.0.1 mmol/L 氣霉素預溫育分離的神經突起 30 min。
3.用溫育液洗漆 6 次，每次 Imin。
4.在含 0.5mCi/ml 反式-35S 和 0.1 mmol/L 氯霉素的溫育液內標記 2.5 h。
5.溫液洗滌 6 次，每次 30 min。
6.20ul SDS 樣本緩沖液收集神經突起，并轉移入微量離心管。
7.煮沸 5 min。
8.樣本于 12OOOr/min, 離心 2 min。
9.取上清液加樣到 8% SDS-PAGE 進行電泳。
10.50% 甲醇和 10% 乙酸固定凝膠 30 min。
11.用擴增儀處理凝膠 20 min。
12.千燥凝膠。
13.在 X 射線膠片（KodakBiomaxMS) 上曝光 1~3 周。
14.顯影膠片
三、結果
為了解神經突起內蛋白的合成部位以及這些部位合成蛋白的異質性，我們應用反式-35St 示記技術通過 35S 標記的半胱氨酸和蛋氨酸標記了離體神經突起。如果離體軸突確實存在蛋白合成，那么這些放射標記的氨基酸將能夠摻入蛋白，并被放射自顯影方法檢測到。結果證明神經突起能夠合成各種各樣的蛋白，而且這個過程主要發生在曲張體和生長錐（圖 3-6)。
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