簡單染色法與革蘭氏染色法

（一）細菌的簡單染色法
1 目的
1.1 學習微生物  涂片、染色的基本技術。
1.2 掌握細菌的簡單染色法。
1.3 初步認識細菌的形態特征，鞏固學習油鏡的使用方法和無菌操作技術。
2 原理
細菌的涂片和染色是微生物學實驗中的一項基本技術。細菌的細胞小而透明，在普通的光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色。利用單一染料對細菌進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態和結構。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。
常用堿性染料進行簡單染色，這是因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子  的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色。經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有美藍、結晶紫、堿性復紅等。
當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。
染色前必須固定細菌。其目的有二：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原有的形態。
3 材料
3.1 菌種
枯草芽孢桿菌12～18h營養瓊脂斜面培養物，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)約24h營養瓊脂斜面培養物，大腸桿菌（Escherichia coli）24h營養瓊脂斜面培養物。
3．.2 染色劑
呂氏堿性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)，石炭酸復紅染液。
3.3 儀器或其他用具
顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環，玻片擱架、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)，擦鏡紙，生理鹽水或蒸餾水等。
4 流程
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢。
5 步驟
5.1 涂片
取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴生理鹽水(或蒸溜水)于玻片中央，用接種環以無菌操作（圖2-1），分別從枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和大腸桿菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。若用菌懸液(或液體培養物)涂片，可用接種環挑取2～3環直接涂于載玻片上。注意滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。
5.2 干燥
室溫自然干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。但切勿離火焰太近，因溫度太高會破壞菌體形態。
5.3 固定
如用加熱干燥，固定與干燥合為一步，方法同干燥。 圖 2-1 涂片、干燥和熱固定
5.4 染色
將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍染色1～2min，石炭酸復紅(或草酸銨結晶紫)染色約1min 。
5.5 水洗
傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。水洗時，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。
5.6 干燥
甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。
5.7 鏡檢
涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。
6 結果
繪制單染色后觀察到的大腸桿菌和藤黃微球菌的形態圖。
（二）革蘭氏染色法
1 目的
1.1 了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性.
1.2 學習掌握革蘭氏染色技術，鞏固學習光學顯微鏡油鏡的使用方法。
2 原理
革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家Christain Gram氏創立的，革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法。
革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結晶紫進行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色，最后用復染劑(如番紅)復染。經此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌。
革蘭氏染色法所以能將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結構和組成不同決定的。實際上，當用結晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫一碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成，壁厚、類脂質含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。