純化非肌肉肌球蛋白實驗

細胞

緩沖鹽溶液 二異丙基氟瞬酸 勻漿緩沖液

相差顯微鏡

1. 準備下面的貯液和材料。

等滲的緩沖鹽溶液（例如 PBS，150 mmol/L NaCl；10 mmol/L NaPO₄，pH 7.2)

二異丙基氟瞬酸（DIFP）

1 mol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

0.5 mmol/L K⁺EGTA，pH 7.0

0.1 mol/L K⁺ATP，pH 7.0

0.1 mol/L DTT

NaN₃

蛋白酶抑制劑

PMSF

抑胃酶肽 A

亮抑酶肽

刀豆胰蛋白酶抑制劑

勻漿緩沖液：

0.34 mol/L 蔗糖

20 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

5 mmoI/L K⁺EGTA，pH 7.0

5 mmol/L K⁺ATP，pH 7.0

5 mmol/L DTT ( 干粉或用貯存液）

50 μmol/L PMSF

3 mmol/L NaN₃

22 μmol/L 抑胃酶肽 A

1.2 μmol/L 亮抑酶酞

10 μmol/L 刀豆胰蛋白酶抑制劑

PMSF 可以用 pAPMSF 代替，它更穩定，但更貴。

2. 洗細胞：輕輕地沉降細胞（例如 3000 g 離心 5 分鐘），去掉培養基，通過振搖打碎沉淀物，然后重懸于至少 10 倍體積冰冷的等滲緩沖鹽水中。再次在新鮮的等滲緩沖鹽水中沉降和重懸，總共 3 次。對于不同的細胞類型，離心力和時間應該進行優化。

3. 最終的冰冷的細胞懸液中補加 DIFP，使終濃度為 5.7 mmol/L（每毫升細胞懸液中加 1 μl）。冰浴 5 分鐘。

4. 上述的步驟 2 沉降細胞，然后重懸于 4~6 倍勻漿緩沖液中。

5. 細胞勻漿要造成最大破壞，但要盡量減少氧化。

6. 用相差顯微鏡檢測細胞的裂解，證實超過 99% 都已經裂解了。